巴贝斯虫分歧虫种铁获取策略及其对铁剥夺的适应性蛋白质响应研究

《PLOS Pathogens》：Iron sourcing strategies and adaptive protein responses to iron deprivation in the intraerythrocytic parasite Babesia divergens

铁对于巴贝斯虫属（Babesia）寄生虫的生存和致病性不可或缺，然而其铁获取机制在很大程度上仍未阐明。与其他顶复门（apicomplexan）寄生虫不同，蜱传巴贝斯虫属物种在入侵红细胞后迅速丢失寄生泡（parasitophorous vacuole），且不形成疟色素（hemozoin），提示其演化出独特的铁代谢策略。本研究表明，分歧巴贝斯虫（Babesia divergens）利用一种序贯式、多途径的铁获取系统以满足其在宿主红细胞内的代谢需求。动力学摄取分析揭示其对亚铁（Fe2+）具有显著偏好，该过程通过一种活跃的、能量依赖的机制导入，并由细胞外铁还原酶（ferric reductase）活性支持，该酶在摄取前将宿主来源的三价铁（Fe3+）转化为生物可利用形式。利用免疫金标记透射电子显微镜（immunogold transmission electron microscopy），研究人员提供了宿主转铁蛋白（transferrin）被主动内化的证据，并显示去铁转铁蛋白（apo-transferrin）以剂量依赖方式抑制寄生虫增殖，确立铁为寄生虫生长的限制因子。定量蛋白质组学分析揭示了对去铁胺（deferoxamine，DFO）诱导的铁剥夺的有限、阶段特异性响应。在游离裂殖子（free merozoites）中，三种蛋白质的丰度出现统计学显著变化：保守的多跨膜蛋白Bdiv_019230增加，而假定蛋白Bdiv_002300和推定丝氨酸羟甲基转移酶（serine hydroxymethyltransferase）Bdiv_027330减少。在红细胞内寄生虫中，无蛋白质达到统计学显著性阈值。这些结果确定了一小批具有统计学支持的候选分子，用于研究细胞外分歧巴贝斯虫裂殖子在铁受限条件下的响应。

一、研究背景与科学问题

铁是顶复门寄生虫生存和致病性所必需的微量营养素，在能量代谢、DNA复制与修复以及氧化还原调控等关键生物学过程中发挥不可替代的作用。宿主通过“营养免疫”机制螯合铁以限制病原体生长，因此寄生虫必须发展出主动获取铁的机制。顶复门寄生虫获取铁通常依赖两种主要途径：通过转运蛋白直接摄取宿主游离铁，或通过受体介导的内化作用摄取与宿主蛋白（如转铁蛋白）结合的铁。然而，巴贝斯虫属物种在红细胞入侵后仅形成短暂的寄生泡，且不形成疟色素，这与恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）等其他红细胞内寄生虫存在根本差异，提示其可能演化出独特的铁代谢策略。尽管如此，巴贝斯虫可获取的铁源的确切性质及其获取和利用的分子机制在很大程度上仍未阐明。基于此，研究人员开展了本研究，旨在解析分歧巴贝斯虫（Babesia divergens）的铁获取机制及其对铁剥夺的适应性响应，以期为巴贝斯虫病（babesiosis）的治疗干预提供新的分子靶点。

二、研究内容与主要结论

研究人员通过一系列互补的实验方法，系统阐明了分歧巴贝斯虫的铁获取策略及其对铁剥夺的蛋白质组响应。研究发现，该寄生虫采用一种序贯式、多途径的铁获取系统：首先通过细胞外铁还原酶活性将宿主来源的三价铁（Fe³⁺）还原为生物可利用的二价铁（Fe²⁺），随后通过能量依赖的主动转运过程将亚铁导入细胞内；同时，寄生虫能够内化宿主转铁蛋白并利用其结合的铁支持自身在红细胞内的增殖。定量蛋白质组学分析揭示了游离裂殖子对铁螯合剂去铁胺（DFO）处理的特异性蛋白质响应，鉴定出三个丰度显著变化的蛋白质，其中Bdiv_019230（预测为多跨膜蛋白）丰度增加，而Bdiv_002300（假定蛋白）和Bdiv_027330（推定丝氨酸羟甲基转移酶）丰度降低。这些发现不仅深化了对铁依赖性宿主-寄生虫相互作用的理解，也为针对巴贝斯虫铁代谢的干预策略提供了潜在的分子靶点。

三、主要技术方法

本研究采用了以下关键技术方法：（1）放射性同位素标记铁摄取实验，使用⁵⁵Fe标记的不同铁源（Fe(II)-抗坏血酸、Fe(III)-柠檬酸、Fe-转铁蛋白）定量分析寄生虫的铁摄取动力学及温度依赖性；（2）BPS（亚铁特异性螯合剂）抑制实验和铁嗪（ferrozine）比色法测定细胞外铁还原酶活性；（3）免疫金标记透射电子显微镜（immuno-TEM）直接可视化转铁蛋白在寄生虫内的定位；（4）去铁转铁蛋白补充培养实验评估铁限制对寄生虫增殖的影响；（5）无标记定量蛋白质组学（label-free quantitative proteomics）分析，基于Orbitrap质谱系统，比较DFO处理与对照条件下游离裂殖子和红细胞内寄生虫的蛋白质组差异，数据经MaxQuant和Perseus软件处理，采用置换检验FDR确定显著性阈值。

四、研究结果

1. 还原性铁摄取使铁能够整合入分歧巴贝斯虫的蛋白质复合物

通过放射性铁摄取动力学分析，研究人员发现转铁蛋白结合铁表现出最高的摄取速率（6.76 ± 0.30 nmol Fe·min^-1·g^-1蛋白），其次为Fe(II)-抗坏血酸（3.73 ± 0.40 nmol Fe·min^-1·g^-1蛋白），Fe(III)-柠檬酸的摄取速率最低（2.47 ± 0.20 nmol Fe·min^-1·g^-1蛋白），表明寄生虫偏好亚铁形式。4°C低温孵育使转铁蛋白和Fe(II)摄取分别下降44.4%和48.7%，证实铁摄取主要依赖能量驱动的主动转运过程。BPS（亚铁特异性螯合剂）处理使Fe(III)-柠檬酸的细胞相关放射性显著降低约49%，证实三价铁须先被还原为亚铁才能被摄取。铁嗪比色法进一步确认游离裂殖子具有可测量的细胞外铁还原酶活性（2.14 ± 0.23 pmol/min/10⁶细胞）。蓝色天然凝胶电泳（BN-PAGE）结合放射自显影显示，内化的放射性铁定位于离散的高分子量蛋白质复合物中，表明铁被功能性整合入代谢相关的含铁蛋白复合体。

2. 转铁蛋白结合铁的利用支持分歧巴贝斯虫在宿主红细胞内的增殖

去铁转铁蛋白补充实验显示，15 mg/mL去铁转铁蛋白处理在48小时时使寄生虫血症显著降低约49%（p < 0.0001），而6 mg/mL浓度影响可忽略，呈现剂量依赖性抑制效应。补充Fe(III)-柠檬酸可恢复寄生虫生长至接近对照水平。免疫金标记透射电子显微镜在红细胞内分歧巴贝斯虫的细胞质和细胞器区室中明确检测到转铁蛋白的定位，直接证实了寄生虫对转铁蛋白的内化能力。这些结果共同表明，转铁蛋白是寄生虫的生理性铁源，铁的可利用性是限制寄生虫增殖的关键因素。

3. 蛋白质组学分析揭示分歧巴贝斯虫血液阶段对铁螯合的阶段特异性响应

无标记定量蛋白质组学分析在游离裂殖子样本中鉴定出1,455个寄生虫蛋白质，在红细胞内寄生虫样本中鉴定出590个蛋白质。火山图分析显示，DFO处理后游离裂殖子中有三个蛋白质的丰度出现统计学显著变化：Bdiv_019230（预测多跨膜蛋白）丰度增加，而Bdiv_002300（假定蛋白）和Bdiv_027330（推定丝氨酸羟甲基转移酶）丰度降低。红细胞内寄生虫中无蛋白质达到显著性阈值。PSI-BLAST同源分析表明Bdiv_019230在多种巴贝斯虫物种中存在高置信度同源物，包括推定整合膜蛋白、核苷转运蛋白和含CLN3结构域蛋白，提示其可能具有转运蛋白样功能，但其底物特异性和与铁转运的直接关联尚未确立。

五、讨论与结论

本研究证实分歧巴贝斯虫采用序贯式、多途径的铁获取系统：初始的三价铁还原（可能由寄生虫编码的还原酶介导）、亚铁的主动转运以及通过未表征但功能性的内化途径利用宿主转铁蛋白结合铁。寄生虫同时利用无机铁和转铁蛋白结合铁的能力凸显了其对宿主环境的适应能力。Bdiv_019230在铁剥夺条件下的显著上调使其成为研究寄生虫铁限制响应的候选分子。此外，DFO处理后游离裂殖子中推定硫氧还蛋白（Bdiv_001970c）的缺失可能反映铁限制条件下抗氧化防御能力的下调，鉴于巴贝斯虫依赖Trx/TrxR/NADPH系统应对宿主氧化应激，这一发现提示铁限制与氧化还原稳态之间存在功能关联。虽然Bdiv_001180在两种阶段均显示出一致的丰度增加趋势（游离裂殖子2.6倍，红细胞内寄生虫4.65倍），但未达到统计学显著性阈值，其预测的表面定位及远缘真菌同源物作为血红素/血红蛋白受体的功能，使其成为值得未来研究的假设生成候选分子。总体而言，本研究揭示了巴贝斯虫铁代谢的灵活协调策略，为理解铁依赖性宿主-寄生虫相互作用提供了新见解，并将寄生虫铁代谢确立为未来巴贝斯虫病治疗干预的潜在靶点。