静脉化使血管生成不依赖VEGFR信号

《Nature》：Venousization enables angiogenesis in the absence of VEGFR signalling

　　

血管内皮生长因子（VEGF）配体及其主要受体VEGFR2被认为对血管内皮细胞的分化、增殖、出芽和存活至关重要¹。当所有细胞中VEGF–VEGFR2信号受损时，生长中的胚胎或组织无法形成血管^2,3。抗VEGF抗体可阻断癌症、伤口愈合或缺血性疾病中的血管生成，是临床上最广泛使用的抗体之一。然而，已有抗VEGF治疗血管抵抗的报道^4,5。本研究使用iFlpMosaics和iSuRe–HadCre在整个胚胎期和出生后发育过程中诱导并追踪缺乏VEGFR2的血管内皮细胞（ECs）遗传嵌合体。这些Vegfr2敲除（Vegfr2KO）ECs能够适应、正常增殖并与野生型细胞竞争，最终在大多数器官中形成血管网络的相当部分。在大多数组织中，Vegfr2KO ECs无法在第一波血管生成中出芽，因为该过程高度依赖VEGF并有利于野生型ECs的生长和动员。然而，由于无法响应VEGF，Vegfr2KO ECs在静脉中占据优势，静脉成为后续不依赖VEGF的血管生成波的长期持续ECs来源。对急性和长期丧失VEGFR2的ECs进行比较单细胞RNA测序分析，鉴定了适应和抵抗VEGF信号丧失的共有及器官特异性分子机制，包括显著的血管内皮静脉化和VEGFR1及VEGFR3配体的上调。VEGFR1仅在毛细血管ECs中部分代偿VEGFR2的丧失，而VEGFR3仅在动脉ECs中代偿。三个VEGF受体同时缺失不影响静脉生长。值得注意的是，静脉发育主调控因子NR2F2（又称COUP-TFII）的缺失显著损害了Vegfr2KO ECs的扩增。本研究对理解VEGF受体在血管生成中的作用具有重要意义，并证明静脉化是血管生成过程中适应和抵抗VEGF信号丧失的一种机制。

　　VEGF信号通路在临床中常被靶向以抑制肿瘤血管生成、转移和视网膜疾病⁶，但抗VEGF阻断抗体的耐药性随时间出现，限制了治疗效果^4,5,7,8。然而，在生理性血管发育过程中，VEGF信号丧失的抵抗性尚未见报道。所有细胞中VEGF信号通路活性缺失的胚胎或出生后组织无法发育出血管³。VEGFR2（小鼠中由Kdr又称Vegfr2基因编码）是最重要的VEGF受体，已被证明在迄今研究的所有血管发育情境中对血管生成至关重要^1,9。该基因的生殖系突变体完全缺乏血管并在胚胎发育极早期死亡²，由野生型和Vegfr2敲除（Vegfr2KO）祖细胞形成的小鼠胚胎嵌合体也无法形成血管内皮细胞（ECs）¹⁰。内皮分化后用Tie2–Cre条件性删除Vegfr2¹¹，或在出生后组织中使用Cdh5–CreERT2删除¹²，同样严重损害血管生成，且无遗传代偿或抵抗的证据。尽管大量文献表明VEGFR2对内皮分化、增殖、迁移和存活至关重要，但先前在所有ECs中删除Vegfr2（Vegfr2iDEC）的研究仅能在相对较短的时间内分析其对血管生成的影响。VEGFR2在血管发育中的关键作用导致Vegfr2iDEC胚胎和出生后动物血管生成严重受损和过早致死，因此此类研究无法确定ECs是否能随时间适应VEGFR2的丧失，或在完全缺乏VEGF–VEGFR2信号的情况下形成某些器官血管床。本研究使用iFlpMosaics¹³和iSuRe–HadCre¹⁴以嵌合方式诱导并纵向追踪Vegfr2KO ECs，从而评估该基因在不同器官整个胚胎期和出生后血管发育中的作用。研究发现，尽管VEGF–VEGFR2信号在胚胎期和出生后初始血管生成波中具有关键作用，但对起源于静脉的许多后续血管生成过程并非必需。Vegfr2KO ECs在静脉血管中扩增并超越野生型ECs，静脉血管作为这些突变细胞在大多数器官中血管生成的持续来源。单细胞RNA测序（scRNA-seq）显示，Vegfr2KO ECs随时间通过上调其他VEGF受体的配体和增加静脉特异性基因（特别是Nr2f2）的表达来适应。靶向这些适应和抵抗相关分子机制可阻止长期丧失VEGFR2信号后ECs的扩增。

　　Vegfr2KO ECs能形成新血管。鉴于VEGFR2在早期血管生成和胚胎发育中的关键作用，研究人员使用iFlpMosaics¹³诱导VEGFR2嵌合缺失，以研究突变细胞是否能随时间适应并形成新血管。该技术能够以FlpO依赖的比例诱导并长期追踪表达MTomato-2A-Cre（任何floxed基因的敲除）或MYFP（野生型）的细胞。为诱导这些嵌合体，研究人员使用了Apln-FlpO等位基因，该基因在胚胎第8.5天（E8.5）的第一批血管生成和出芽ECs中表达，并在整个血管发育过程中持续表达。在雌性胚胎中，位于X染色体的Apln–FlpO等位基因呈嵌合沉默¹⁵，仅在一部分（23–50%）ECs中表达，产生相对少量的突变和野生型细胞，研究发现这与胚胎发育兼容。对Apln-FlpO iFlpMosaic小鼠主要器官的分析显示，完全丧失VEGFR2的ECs（Vegfr2KO-E8.5–P7）能够在胚胎发育期间存活和增殖直至出生后第7天（P7），与野生型细胞相比仅有相对较小的竞争劣势（2–7倍）。这种竞争劣势在肺和肾脏内皮中更为明显，在脑ECs中较轻。由于Apln-FlpO为组成性活跃并可在胚胎发育后期驱动重组，研究人员还使用4-羟基他莫昔芬（4-OHT）在E10.5和E12.5诱导携带Cdh5-CreERT2、iSuRe-HadCre和iMb2-Mosaic¹⁶对照报告基因的胚胎中删除Vegfr2。这导致最多1–6%的ECs重组，而Apln-FlpO为23–50%。然而，这重现了脑ECs受VEGFR2丧失影响最小、其次为心脏、肝脏、肺和肾脏的趋势。

　　Vegfr2KO ECs能形成动脉。VEGFR2活性对NOTCH激活和动脉发育至关重要^17,18,19。动脉由尖端ECs形成²⁰，这些细胞具有最高水平的VEGF–VEGFR2信号并引导血管生长。长期iFlpMosaics的高分辨率空间分区数据显示，Vegfr2KO-E8.5–P7 ECs显著富集于静脉和周围毛细血管，避开血管生成前沿毛细血管或尖端ECs，但能够形成动脉。为补充这些结果，研究人员将Vegfr2 floxed等位基因与Cdh5-CreERT2和iSuRe-HadCre¹⁴等位基因杂交，确保单次注射4-OHT后ECs中快速（24小时）有效的嵌合遗传删除和VEGFR2蛋白及下游靶标的完全丧失。Vegfr2IECKO-P1–P7 ECs主要位于静脉和周围毛细血管，以及视网膜动脉的近端和成熟段。这表明当Vegfr2KO ECs在P1的初始视网膜出芽丛中被诱导时，它们能形成P1至P3形成的动脉。然而，由于无法继续出芽并在前沿形成尖端细胞，它们无法参与P3至P7发生的后续动脉发育过程，该过程在视网膜中依赖于新尖端细胞的整合²¹。值得注意的是，与Vegfr2IECKO-P1?P7 ECs相比，Vegfr2KO-E8.5?P7 ECs在前沿和血管生成前沿毛细血管中更为常见，且仍能形成动脉。这表明胚胎期Vegfr2KO-E8.5?P7 ECs能适应VEGFR2的长期丧失，并在出生后阶段贡献于静脉血管生长、尖端细胞和动脉。

　　Vegfr2KO ECs在静脉中扩增。研究人员接下来研究了鉴于该通路在EC增殖中的重要作用^1,22，Vegfr2KO ECs如何能与野生型细胞竞争并在长时间内贡献于生长的血管网络。在血管生成过程中，EC增殖有两个主要位置：毛细血管血管生成前沿和静脉。研究发现，存活的Vegfr2KO-E8.5?P7 ECs在出生后脑、心脏和肺血管中的增殖（通过Ki-67检测确定）与野生型细胞相当。静脉ECs为血管生成提供持续的ECs来源，这些细胞逆血流迁移至毛细血管然后向动脉血管迁移^20,23,24。当研究人员在更长时间内（P1至P20）诱导Vegfr2KO ECs时，观察到突变细胞停留在静脉干细胞龛中增殖并逐渐超越野生型细胞，后者向外迁移至富含VEGF的前沿和邻近毛细血管。Vegfr2KO ECs对静脉干细胞龛的优先占据使其能够更长时间持续增殖，并在随后P7至P20的第二波不依赖VEGF的血管生成中形成大部分静脉周围毛细血管和深层血管丛。这与先前发现一致，即潜入形成视网膜深层血管丛的尖端细胞缺乏VEGFR2信号靶基因Esm1的表达，其迁移依赖于Alk或TGFβ和WNT信号等其他通路^25,26,27。总之，这些数据表明VEGFR2功能对缺氧胚胎和器官中高VEGF水平驱动的初始出芽血管生成至关重要，但对静脉和静脉周围毛细血管的发育或各器官第一血管丛形成后发生的毛细血管血管生成和重塑的后续步骤并非必需。因此，通过形成静脉——已知为血管生成提供持续的ECs来源²³——Vegfr2KO ECs能够持续增殖并在长时间内参与血管发育的后续步骤。

　　VEGFR2丧失的急性效应与适应。研究人员先前观察到，在长期（Vegfr2KO-E8.5–P7）和短期（Vegfr2IECKO-P1–P7）嵌合删除Vegfr2的动物中，Vegfr2KO ECs在P7视网膜丛中的分布不同。Vegfr2KO-E8.5–P7 ECs在前沿和血管生成前沿中比Vegfr2IECKO-P1–P7 ECs更为常见。Vegfr2KO-E8.5–P7 ECs也正常增殖。因此，研究人员假设Vegfr2KO-E8.5–P7 ECs可能发生了遗传重编程并随时间适应了最重要的VEGF受体的丧失。为评估ECs对VEGFR2丧失的早期反应，研究人员首先分析了生长中视网膜血管的凋亡标志物，因为VEGFR2已被证明调节EC存活。Vegfr2IECKO-P4–P7小鼠显示凋亡（cleaved caspase 3阳性）ECs数量非常显著增加。这种凋亡是对VEGFR2急性丧失的反应，因为Vegfr2KO-E8.5–P7甚至Vegfr2IECKO-P1–P7小鼠未显示任何凋亡ECs，表明存活细胞随时间的适应。当在所有ECs中诱导Vegfr2急性丧失时，研究人员观察到Vegfr2KO ECs立即从高VEGF的血管生成前沿耗竭，但未从静脉或更成熟血管中耗竭。因此，尽管视网膜丛中许多ECs在Vegfr2丧失后最初几天显示凋亡标志物上调，但只有Vegfr2删除时暴露于高VEGF水平的血管生成ECs死亡。研究人员还发现Vegfr2IECKO-P4–P7 ECs仅在心脏和肾脏中增殖显著低于对照细胞，而Vegfr2KO-E8.5–P7 ECs的增殖与对照相似。这表明Vegfr2KO ECs随时间适应并随后能在这些器官中增殖。在新生视网膜中，Vegfr2删除不影响任何节段中存活ECs的增殖，表明在该器官中VEGFR2主要控制EC迁移和存活而非增殖。总之，数据表明在活跃血管生成期间缺乏VEGF信号的ECs经历急性VEGFR2撤除效应，随后是一段适应期，之后能形成新血管。距离VEGF源较远因此VEGF信号较少的ECs对丧失适应更好并能随时间扩增，特别是在静脉和静脉周围血管中。为进一步确认更成熟ECs对VEGFR2信号丧失的不敏感性，研究人员在几个成年静息血管床中删除Vegfr2两周。仅静息肝窦内皮显示强敏感性和Vegfr2KO ECs的丧失，而仅肾脏内皮显示显著较低的增殖，表明仅这些器官中存在的有孔或不连续成熟内皮血管对VEGFR2丧失保持敏感。

　　急性器官型转录变化。鉴于观察到的Vegfr2IECKO-P4–P7和Vegfr2KO-E8.5–P7 ECs生物学差异，研究人员对这些细胞及各自对照Tomato+细胞进行scRNA-seq，以鉴定其转录谱的可能差异以及不同器官血管床中适应VEGFR2信号丧失的潜在机制。尽管VEGFR2是血管生成的中心调控因子并被广泛认为对EC生物学至关重要，Vegfr2IECKO-P4–P7 ECs的转录组仅显示适度变化，即使在4-OHT给药后24小时内VEGFR2蛋白和下游信号已丧失。总体而言，所有分析器官中与出芽或尖端细胞生物学相关的基因表达降低，而与凋亡和血管通透性相关的基因表达增加。然而，器官间观察到相当大的差异。在脑中，Vegfr2删除3天后表达静脉毛细血管标志物的增殖（S–G2–M）ECs簇增加。这与该器官中Vegfr2KO ECs从P1到P20更高的克隆扩增一致。包含毛细血管和活化或血管生成ECs（高表达Apln、Adm、Mcam、Lamb1和Angpt2）的簇减少。总共仅569个基因显著失调。基因集富集分析（GSEA）揭示E2F和MYC靶基因以及G2M、DNA修复和纺锤体基因表达增加，证实EC增殖增加。大多数尖端细胞标志物基因在Vegfr2IECKO-P4–P7脑ECs中表达降低。与脑不同，心脏中Vegfr2IECKO-P4–P7毛细血管ECs增殖显著降低，与切片中Ki-67百分比下降54%一致。突变ECs在较大血管（动脉和静脉）中的比例增加2–4倍，表明仅在3天内Vegfr2KO毛细血管ECs比例性快速耗竭。与脑不同，Vegfr2KO心脏ECs的GSEA显示E2F和MYC靶基因以及G2M、纺锤体和尖端细胞基因表达预期降低，与Vegfr2IECKO-P4–P7心脏ECs增殖和出芽减少一致。Vegfr2KO心脏ECs还显示凋亡和上皮–间充质转化相关基因上调，如先前在丧失ERK信号的ECs中所示²⁸。与脑和心脏结果不同，肺中对照和Vegfr2IECKO-P4–P7 ECs之间增殖细胞比例无显著差异，如Ki-67免疫染色和克隆分析所示。静脉簇比例仅轻微增加，毛细血管簇轻微减少。尽管簇比例无显著变化，GSEA显示NF-κB介导的TNF信号、缺氧和活性氧信号增加以及干扰素反应降低。肺中尖端细胞标志物基因表达仅有小幅下降趋势，几个凋亡相关基因上调。在肾脏中，与心脏类似，Vegfr2删除3天导致较大血管（动脉和静脉）ECs相对比例增加，表明仅3天内一部分毛细血管ECs快速耗竭。肾脏毛细血管ECs的增殖和克隆扩增也降低，如Ki-67免疫染色所示。GSEA显示E2F、G2M和纺锤体基因表达预期降低以及p53、异源物质代谢和凋亡相关基因表达增加，表明P4至P7短期Vegfr2删除后肾脏ECs的细胞应激。与脑和心脏ECs类似，肾脏Vegfr2IECKO-P4–P7 ECs中尖端细胞标志物基因表达也降低。

　　通过静脉化适应VEGFR2丧失。在分析Vegfr2IECKO-P4–P7 ECs之后，研究人员对不同器官的Vegfr2KO-E8.5–P7 ECs进行scRNA-seq，以鉴定与细胞长期适应VEGFR2丧失相关的基因表达差异。与Vegfr2IECKO-P4–P7 ECs相反，Vegfr2KO-E8.5–P7 ECs主要显示基因上调而非下调，包括几个静脉富集基因的显著上调。与脑Vegfr2IECKO-P4–P7 ECs不同，脑Vegfr2KO-E8.5–P7 ECs静脉毛细血管频率增加并显著上调静脉特化关键调控因子Nr2f2。与Vegfr2IECKO-P4–P7 ECs类似，脑Vegfr2KO-E8.5–P7 ECs活化和出芽ECs频率降低且几个尖端细胞基因表达水平较低。Vegfr2KO-E8.5–P7 ECs中差异表达基因（DEGs）数量特别是上调基因远更多（1,621 vs 569 DEGs），这可能代表对VEGFR2功能丧失的长期适应反应。在Vegfr2IECKO-P4–P7脑ECs中，与EC增殖和细胞活动相关的遗传通路（E2F靶标、MYC、氧化磷酸化和糖酵解）反常增加，而在Vegfr2KO-E8.5–P7 ECs中这些通路降低。这表明脑Vegfr2KO-E8.5–P7 ECs通过降低细胞活动和上调Nr2f2来适应VEGFR2信号的长期丧失，这可能降低了它们对VEGF信号的生长和存活依赖性。在心脏中，研究人员确认了先前组织学分析显示心脏Vegfr2KO-E8.5–P7 ECs增殖水平与对照细胞相似且显著高于Vegfr2IECKO-P4–P7 ECs。它们也有更多DEGs（1,750 vs 242 DEGs），特别是上调基因。GSEA显示上皮–间充质转化、KRAS信号和血管生成增加，代谢通路相关基因表达降低，与脑中所见一致。与Vegfr2IECKO-P4–P7 ECs相比，Vegfr2KO-E8.5–P7 ECs中尖端或活化EC基因表达未如此受损，表明随时间对VEGFR2丧失有一定适应。值得注意的是，Vegfr2KO-E8.5–P7 ECs在静脉中的频率高4倍，与视网膜中观察相似，证实Vegfr2嵌合缺失导致突变ECs在静脉中更多扩增。与Vegfr2IECKO-P4–P7 ECs相比，Vegfr2KO-E8.5–P7 ECs显示大多数静脉特异性基因的强上调，包括Nr2f2、Fbln2、Igf1和Vwf。这不仅是由于这些突变体中静脉ECs比例增加；毛细血管和血管生成ECs也显示这些静脉标志物基因表达显著更高，表明Vegfr2KO-E8.5–P7毛细血管ECs随时间的静脉化。在肺中，观察到相同的Vegfr2KO-E8.5–P7 ECs适应和静脉化。突变细胞在静脉中频率高4倍，甚至毛细血管或CAR4+ ECs也显示肺静脉基因包括Vegfc、Nr2f2、Vwf和Fbln2的表达显著上调。与其他器官发现类似，肺Vegfr2KO-E8.5–P7 ECs的DEGs显著多于肺Vegfr2IECKO-P4–P7 ECs（3,116 vs 502），特别是上调基因。火山图和GSEA揭示许多静脉富集和上皮–间充质转化基因以及雌激素反应基因上调。肺Vegfr2KO-E8.5–P7 ECs中E2F靶标和代谢基因表达较低，与其他器官所见一致。值得注意的是，在成年器官血管中删除Vegfr2两周并未诱导成年Vegfr2KO ECs的静脉化；相反，它降低了静脉基因的表达，表明Nr2f2上调和静脉化可能是仅在活跃血管生成期间发生的对VEGFR2丧失的长期适应反应。scRNA-seq数据显示Vegfr2KO-E8.5–P7 ECs随时间的静脉化，这通过静脉发育主调控因子NR2F2（又称COUP-TFII）的免疫染色得到证实。为理解静脉化对Vegfr2KO ECs长期适应的要求，研究人员还分析了Apln-FlpO iFlpMosaic Vegfr2Flox/Flox、Nr2f2Flox/Flox小鼠。当ECs同时缺乏VEGFR2和NR2F2时，其扩增能力显著降低，特别是在静脉中。这表明内皮静脉化是血管生成过程中适应VEGFR2信号长期丧失的关键机制，使突变细胞能够随时间在静脉和衍生血管中扩增。除分析胚胎和出生后血管生成外，研究人员还测试了Vegfr2KO ECs在2周内形成肿瘤血管的能力。当Vegfr2删除在肿瘤植入前几天诱导时，Vegfr2IECKO-day-3–adult ECs主要在肿瘤边缘形成肿瘤血管，未能深入肿瘤内部，其频率比对照ECs低5.2倍。相反，在整个胚胎和出生后发育过程中经历静脉化的Vegfr2KO-E8.5–adult ECs能更好地到达肿瘤内部，仅比对照ECs低2.6倍。这些数据表明尽管VEGFR2信号促进肿瘤血管生成，ECs能逐渐适应其缺失并维持肿瘤血管生成。

　　VEGFR1和VEGFR3的差异代偿。除静脉化的发现外，研究人员观察到Vegfr2KO-E8.5–P7 ECs中其他VEGF受体配体表达的显著上调，包括分别结合并激活VEGFR1和VEGFR3的PGF和VEGFC¹。在VEGFR2缺失时，VEGFR1是唯一能结合VEGFA的其他受体。然而，迄今所有研究表明VEGFR1激酶活性太弱^29,30，而其细胞外可溶形式（sVEGFR1或sFLT1）作为强VEGF诱饵受体³¹。因此，当VEGFR2存在时，VEGFR1被认为主要拮抗VEGFA–VEGFR2信号和血管生成。然而，研究人员发现Vegfr1表达在对VEGFR2丧失最不敏感的器官脑的ECs中高得多。研究人员还发现出生后血管生成期间，除脑ECs外，sVegfr1表达比膜全长Vegfr1（flVegfr1）mRNA形式低2–5倍，表明flVEGFR1具有潜在信号传导作用。为评估VEGFR1是否能代偿VEGFR2的丧失，研究人员使用iSuRe-HadCre从P1到P7在ECs中诱导Vegfr1和Vegfr2的嵌合共缺失（Vegfr1/2IECKO-P1–P7）。与Vegfr2KO ECs相比，Vegfr1/2KO ECs迁移和形成视网膜毛细血管的能力进一步降低，但静脉或动脉未受影响。在静脉中，Vegfr1/2KO ECs能克隆扩增。P7时脑和心脏Vegfr1/2KO ECs增殖低于Vegfr2KO ECs。Vegfr2和Vegfr1同时删除对内皮和幼崽存活有更强影响，证实当毛细血管中VEGFR2缺失时需要VEGFR1信号。单独嵌合删除Vegfr1也导致ECs向富含VEGF前沿的迁移减少。与所有ECs中Vegfr1删除不同，单个ECs中Vegfr1的嵌合丧失未增加VEGF信号（通过ESM1表达评估），可能是由于大部分野生型微环境中sFLT1水平正常。除VEGFR1和VEGFR2外，ECs表达VEGFR3。先前研究表明VEGFR3在毛细血管和静脉ECs中强表达；然而，该受体不能结合VEGF（VEGFA），仅结合VEGFC和VEGFD，这些是淋巴管生成的关键分子但与血管生成相关性较低。Vegfr2IECKO-E8.5–P7 ECs显示VEGFC非常强的上调，在VEGFR2缺失时可能向VEGFR3发出信号。生长中视网膜ECs中VEGFR3的丧失已被证明诱导血管生成，表明VEGFR3负调控VEGFR2信号³²。然而，单个Vegfr3IECKO-P1–P7 ECs迁移和到达前沿的能力也降低。动脉ECs和平滑肌细胞表达高水平VEGFC^33,34,35，该配体可结合VEGFR2和VEGFR3。与Vegfr2IECKO-P1-P7 ECs相比，Vegfr2/3IECKO-P1-P7 ECs在毛细血管和静脉中分区分布非常相似，但在动脉中频率低3.4倍；这表明VEGFC–VEGFR3信号在动脉动员或存活中的重要作用，但仅在VEGFR2信号缺失时。VEGFR2和VEGFR3同时丧失不影响任何血管节段中存活ECs的增殖。研究人员还观察到Vegfr2KO ECs仅在VEGFA水平最高的血管生成前沿VEGFR3表达降低。相反，Vegfr1/2KO ECs在除动脉外的所有血管节段中显示VEGFR3强下调。Vegfr1/2/3IECKO-P1-P7 ECs的行为与Vegfr1/2IECKO-P1-P7 ECs相似，除动脉血管形成显著减少外。总之，研究结果表明在VEGFR2信号缺失时，VEGFR1是维持VEGFR3表达以及毛细血管EC生长和迁移所必需的。在动脉中，VEGFR1和VEGFR2丧失后VEGFR3继续表达，并在其他VEGFA受体缺失时调控动脉发育。值得注意的是，静脉ECs能在所有VEGF受体信号完全缺失时存活并克隆扩增。

　　讨论部分。本研究挑战了VEGFR2信号在血管生成中对内皮增殖、迁移和出芽不可或缺的长期观点^1,22。通过使用iFlpMosaics诱导野生型和Vegfr2KO ECs的比例遗传嵌合体，研究人员证明这些突变细胞能够在整个胚胎和出生后器官生长期存活、增殖并与野生型ECs竞争。与先前认为VEGFR2对所有形式的血管分化和发育必需的研究^10,12,36相反，本研究发现不依赖VEGFR2的机制支持某些血管床的血管生成，特别是静脉和静脉周围毛细血管的长期发育。研究人员鉴定了对VEGFR2信号急性丧失适应性的显著器官特异性差异，从而扩展了先前的发现^37,38。血管生成视网膜ECs受到强烈影响，而脑ECs受影响最小，保留高血管生成潜能，部分由于VEGFR1代偿。相反，出生后心脏、肾脏和肝脏ECs对VEGFR2急性撤除更敏感，显示毛细血管中Vegfr2KO ECs的部分耗竭以及增殖的部分降低。出生后肺显示独特反应，EC增殖或簇组成无重大变化，而是转录程序向炎症和代谢适应转变。这些发现突出了不同血管床内皮反应的异质性，并表明器官特异性因素影响ECs对VEGF信号扰动的韧性。Vegfr2KO ECs的长期适应是一个值得注意的观察。尽管这些细胞在早期胚胎和出生后出芽血管生成阶段最初具有竞争劣势，但它们最终在静脉和静脉周围区域扩增并超越野生型细胞，表明替代通路支持其在该微环境中的存活和增殖。已知静脉为毛细血管血管生成和后续动脉化提供持续的ECs来源^20,23，Vegfr2KO ECs的这种静脉优势使其能随时间与野生型细胞竞争。对不同血管床的scRNA-seq分析进一步显示，长期丧失VEGFR2的ECs表现出向静脉转录特征的显著转变（静脉化），以许多静脉基因上调为标志，包括静脉发育主调控因子Nr2f2^24,39。Vegfr2KONr2f2KO ECs扩增能力显著降低，特别是在静脉中，表明静脉化是使Vegfr2KO ECs持续存在并贡献于血管发育的关键适应机制。除静脉化外，研究结果还证明VEGFR1和VEGFR3在VEGFR2缺失时支持存活和生长信号的代偿作用。先前主要报道VEGFR1在血管生成中负调控VEGFR2信号，因为其可溶性分泌版本sFLT1或VEGFR1是VEGF的诱饵受体^1,22。在嵌合Vegfr1KO和Vegfr1/2KO实验中，微环境中sFLT1水平正常；这使研究人员发现膜或全长VEGFR1作为血管生成的正调控因子并部分代偿VEGFR2丧失，支持EC存活和迁移。VEGFR3的嵌合单缺失也显示该受体是EC向前沿迁移的正调控因子。这与使用VEGFR3阻断抗体的结果一致⁴⁰；然而，研究发现与泛内皮Vegfr3KO遗传实验³²相反，后者中受体从所有ECs中丧失。在这种情况下，全身VEGFC和/或VEGFD生物利用度增加，从而增加VEGFC–VEGFR2信号，而在低频Vegfr3KO嵌合体中这不会发生。此外，与Vegfr2KO ECs相比，Vegfr2/3KO ECs向血管生成前沿的动员较少且动脉化减少。这些替代VEGF受体在单细胞水平维持EC存活、迁移和增殖的能力表明VEGF信号网络内的潜在功能可塑性和代偿，如先前使用经典全组织条件遗传学研究所示^12,32,37。本研究的一个重要意义是ECs对VEGFR2丧失的敏感性因血管背景和丧失后时间而异。研究人员发现活跃血管生成期间VEGFR2急性丧失导致最初3天内显著的EC耗竭，特别是尖端细胞和其他位于VEGF信号最高的血管生成前沿的ECs耗竭。然而，VEGF低区域的Vegfr2KO ECs和经历长期适应的ECs能够持续存在甚至贡献于相当部分的毛细血管，特别是静脉周围的毛细血管。这表明经历长期VEGFR2缺陷的ECs在VEGF低区域发生静脉化，使其能够在经典VEGF信号缺失时存活并随后生长。肿瘤模型显示Vegfr2KO ECs能形成肿瘤血管，特别是如果它们在胚胎血管生成期间已经历静脉化。使用比例和可追踪的iFlpMosaics是获得这些发现的关键。本研究还可能为抗VEGF治疗的耐药机制提供生物标志物和见解^5,41,42,43。ECs通过参与替代静脉相关血管生成通路适应VEGFR2丧失也可能发生在肿瘤中。如果得到证实，同时阻断此处鉴定的代偿和静脉相关通路的治疗策略可能是克服抗VEGF治疗耐药所必需的。总之，本研究通过证明ECs具有适应VEGFR2信号长期缺失的内在机制，重塑了对VEGFR2依赖性血管生成的理解。内皮静脉化和代偿性VEGF受体信号的发现为研究血管发育的替代模式和抗VEGF治疗耐药提供了新框架。