胶质母细胞瘤异质性源于癌细胞从发育样状态向胶质损伤反应及缺氧状态的时空轨迹

《Nature》：A spatiotemporal cancer cell trajectory underlies glioblastoma heterogeneity

癌细胞在胶质母细胞瘤（GB）这一不可治愈的脑肿瘤中呈现高度异质性和可塑性状态。然而，这些恶性状态如何产生以及是否在不同肿瘤间遵循确定的细胞轨迹，目前尚不清楚。研究人员构建了人类GB的深度单细胞和空间多组学图谱，将12个肿瘤多个区域的转录组、表观基因组和基因组图谱相结合。研究人员发现GB异质性由癌细胞从发育样状态向胶质损伤反应和缺氧状态的时空模式化转变所驱动。该细胞轨迹将肿瘤区域化为不同的组织微环境，并在不同肿瘤以及遗传上不同的肿瘤亚克隆中呈现分子保守性。一致地，研究人员利用新的深度学习框架在原位联合映射癌细胞状态与克隆，发现肿瘤亚克隆在GB组织微环境中精细空间混合。研究人员通过体内体细胞突变层级和体外患者来源类器官模型验证了该细胞轨迹。最后，研究人员发现该癌细胞轨迹与髓系异质性密切相关，并在区域化髓系信号环境中展开。研究结果定义了GB中癌细胞的刻板轨迹，并将GB肿瘤异质性统一为可操作的细胞和组织框架。

胶质母细胞瘤（GB）是成人不可治愈的脑肿瘤，其广泛的肿瘤异质性构成治疗的主要障碍。近二十年的分子图谱研究（molecular profiling）发现，恶性细胞以多种细胞状态（cellular states）谱系存在于每个肿瘤内，类似发育期神经祖细胞（developmental neural progenitors）以及间充质样（mesenchymal-like）和损伤反应状态。这些状态在不同肿瘤间丰度各异，并可将GB分为不同亚型（subtypes）。此外，患者来源异种移植（patient-derived xenografts）显示恶性细胞可在细胞状态间转换，表明其具有可塑性（plasticity）。尽管已有大量研究，研究人员仍不清楚癌细胞如何向不同状态多样化并产生GB异质性。特别是，恶性细胞是否在不同GB肿瘤间遵循刻板（stereotyped）或可变的细胞轨迹仍属未知。一个在GB间保守且可操作的癌细胞轨迹将是极具吸引力的治疗靶点。单细胞、批量和空间基因组学已揭示GB的刻板特征。每个肿瘤内可检测到多种恶性细胞状态，其单细胞转录谱可映射到发育样（dev-like）与损伤反应相关基因表达程序之间的轴线上。遗传异质性（genetic heterogeneity）和肿瘤微环境（TME）信号也影响恶性细胞状态身份。此外，这些状态在肿瘤间呈现反复出现的空间组织模式。然而，这些观察尚未被联系起来以解析GB中的恶性细胞轨迹，部分原因是缺乏能整合多种细胞和组织图谱技术的多模态图谱分析（multimodal profiling）工作。本研究通过人类GB的深度单细胞和空间多组学图谱分析应对这一挑战，并鉴定出一个刻板的时空癌细胞轨迹产生了GB异质性。

为全面解析GB异质性，研究人员构建了12个异柠檬酸脱氢酶野生型（IDH-wt）原发性GB肿瘤的单细胞和空间多组学图谱，结合三种主要方法。第一，对每个肿瘤的多个位点进行分析，大多数病例取4个位点（每个约1.25 cm3），最多达15个位点有效覆盖一个完整肿瘤，共覆盖57个肿瘤位点。第二，从每个采样位点生成配对的单核和空间组学数据，对连续组织切片进行单核联合转录组测序和染色质可及性测序（“multiome” snRNA+ATAC-seq）以及Visium空间转录组学（ST）。选定位点采用正交Xenium ST和免疫组织化学以及肿瘤微型活检的全基因组测序（WGS）进行分析。第三，对大量细胞核（超过100万个）和空间组织切片（97个Visium切片中超过30万个空间转录组）进行分析。由此产生的“GBM-space”数据集可在交互式门户网站（www.gbmspace.org/）上获取，能够对GB进行全面的多模态表征。

为检查GB异质性，研究人员首先在多组学数据中注释恶性和TME细胞状态。经过标准数据处理流程，根据RNA和ATAC图谱质量过滤细胞核，获得1,025,329个细胞核，每个肿瘤平均超过85,000个。研究人员使用scVI整合snRNA-seq数据以校正批次变异，然后根据推断的第7号染色体（chr. 7）拷贝数（CN）获得和第10号染色体缺失以及已知GB表达程序的富集来区分恶性簇。亚聚类产生28个恶性簇，包括10个在50%肿瘤中存在的高度常见簇，以及71个TME簇。研究人员通过将恶性簇与GB细胞状态基因程序以及发育中人脑scRNA-seq数据相关联并进行基因集富集分析来注释恶性簇。结果，研究人员将恶性簇层级分组为四个主要类别和九个亚类的GB细胞状态，每个均在多个肿瘤中观察到。

两个主要GB细胞状态类别类似不同的发育祖细胞：神经祖细胞样和少突胶质祖细胞样（NPC-OPC-like）以及神经元祖细胞样和神经元样（NPC-neuronal-like）细胞。这两个发育样状态分别表达少突胶质（PDGFRA、OLIG1）和神经元谱系（MYT1L、STMN2）的发育标志物。第三个主要GB细胞状态显示从星形胶质祖细胞（AC-prog）样到胶质增生样（即胶质损伤反应）和缺氧状态的转录组谱，广泛表达核心星形胶质标志物（SLC1A3、GFAP）。AC-prog样细胞显示Neftel“AC-like”特征并类似发育胶质母细胞，AC-胶质增生和胶质增生样细胞表达与创伤愈合和损伤反应（VIM、SERPINE1）及血管生成（VEGFA）相关的基因，其余细胞由缺氧（HILPDA）定义。胶质增生-缺氧细胞最初被描述为由Neftel“MES1-2”程序定义的间充质样状态，最近被重新解释为更类似于响应损伤的反应性星形胶质细胞和胶质创伤愈合状态。研究人员采用后一种命名法以更好地反映图谱中的恶性细胞轨迹。最后的主要恶性状态代表增殖细胞。尽管以G2M和S期基因表达为主，研究人员确定这些细胞代表主要GB细胞状态的活跃循环类似物。

GB细胞状态显示显著的肿瘤间和肿瘤内异质性。大多数肿瘤显示主要类别中有一个优势GB细胞状态。然而，尽管存在分层，每个肿瘤均含有相当比例的发育样和AC-胶质增生-缺氧细胞。两个肿瘤（AT4和10）显示两类比例几乎相等，而在其他肿瘤中，少数状态占所有恶性细胞的5-21%。单个采样位点也含有反映亲本肿瘤的GB状态混合物。然而，研究人员常能识别每个肿瘤中至少一个具有独特细胞状态组成的位点。在一个显著例子中，肿瘤AT10在每个位点显示不同的优势GB细胞状态。这些观察表明单次活检可能混淆GB肿瘤表型的分层。

接下来，研究人员检查GB细胞状态的空间组织。为在Visium ST数据中解析精细GB状态，研究人员使用cell2location将每个患者snRNA-seq图谱中的恶性和TME簇映射到其匹配的Visium数据。GB细胞状态在所有肿瘤中显示显著分离。特别是，胶质增生和缺氧细胞状态与发育样状态分离。GB状态在肿瘤采样位点间也显示区域异质性。研究人员然后询问GB是否具有保守的空间架构。为确定恶性和TME细胞是否组装成刻板的组织微环境（TMs），研究人员首先通过cell2location结果的非负矩阵分解（NMF）识别每个肿瘤的空间共定位细胞状态（即微环境）。这产生192个因子，然后研究人员按细胞状态相似性聚类以识别16个在肿瘤间反复出现的TMs。研究人员根据细胞组成和解剖位置注释反复出现的GB TMs。“肿瘤”TMs代表肿瘤核心中的恶性、免疫和血管状态，而“浸润”TMs涵盖周围浸润区域中的非恶性神经元和胶质细胞。大多数肿瘤TMs由其独特的GB细胞状态组成定义并在许多肿瘤中出现。核心恶性TMs如Dev-like（OPC）、Dev-like（AC）、增殖性、胶质增生过渡、胶质增生和缺氧1在超过50%的肿瘤中检测到。关键的是，12个肿瘤中有8个显示几乎所有核心TMs，表明这些特征是GB组织的基本特征。研究人员还在公共GB Visium ST数据集上重现了这些TMs。将GB TMs与肿瘤解剖结构相关联显示Dev-like TMs出现在毗邻浸润肿瘤和前沿的细胞肿瘤区域。相比之下，胶质增生和缺氧TMs定位在距浸润区域更远处，在坏死周围和坏死区域形成层状带。为量化其精确空间排列，研究人员计算了所有肿瘤中GB TMs的成对空间邻近性并构建网络图。这显示GB TMs沿浸润肿瘤边缘和坏死肿瘤核心之间的主要解剖轴排列。Dev-like（OPC）发现最接近浸润白质。Dev-like（AC）与Dev-like（OPC）空间重叠，但向肿瘤更深处延伸至胶质增生过渡、胶质增生和缺氧的连续层次。研究人员用正交315-plex Xenium ST数据验证了这些观察，确认了恶性细胞状态分区。Xenium还使研究人员能够验证cell2location预测在GB数据上的准确性。GB TMs也反映TME组织。“血管”捕获周细胞、VLMCs和内皮细胞，在解剖上与微血管增殖和增生血管相关，并发现紧邻Dev-like（AC）和（OPC）、胶质增生过渡和增殖性恶性TMs。“免疫”TMs捕获不同的髓系细胞区室。在浸润区域中，“白质”发现紧邻肿瘤前沿，与作为主要GB侵袭途径一致。总之，研究人员揭示了GB中恶性细胞从发育样到胶质增生和缺氧状态的刻板逐步空间转变。

研究人员提出GB状态的刻板空间转变与其细胞轨迹相关。具体而言，研究人员提出随着GB肿瘤在前沿向正常脑组织扩展，发育样恶性细胞逐渐向胶质增生和缺氧状态转变。为验证这一点，研究人员首先检查了与胶质增生和缺氧相关的推定恶性轨迹。在snRNA-seq数据中，研究人员观察到星形胶质、损伤反应和缺氧相关基因通过AC-胶质增生-缺氧状态的表达梯度。AC-prog样状态显示最高水平的发育和稳态星形胶质基因表达（EGFR、SLC1A3、AQP4、ALDH1L1）。这些在AC-胶质增生样细胞中下调，并被类似星形胶质增生（astrogliosis）的转录组程序取代，包括与胶质瘢痕形成相关的整合素-N-钙黏蛋白通路基因（ITGAV、ITGB1、CDH2）。该程序在胶质增生样细胞中扩展至与JAK-STAT信号传导、创伤愈合、细胞因子产生和凝血以及血管生成和缺氧相关的基因。该轨迹终止于缺氧和应激反应基因表达。全转录组伪时间分析产生一致结果。虽然以前认为类似间充质细胞，研究人员观察到胶质增生-缺氧状态中关键上皮-间充质转化调节因子（如SNAI1/2、TWIST1/2、ZEB1/2）的表达可忽略且非特异性。因此，研究人员的命名法将这些状态置于胶质损伤反应和缺氧的更具体生物学背景中，推测起源于发育星形胶质样恶性细胞。分子轨迹在空间上相应模式化，在ST数据中表现为AC-胶质增生-缺氧状态的同心分离。AC-prog样细胞位于Dev-like（AC）微环境中的非坏死细胞肿瘤中。AC-胶质增生样和胶质增生样细胞分别形成胶质增生过渡和胶质增生微环境，在某种程度上空间混合。在AT10等肿瘤中，AC-胶质增生样位于细胞肿瘤边缘并在坏死周围区域内逐渐过渡为胶质增生样。缺氧细胞位于肿瘤坏死核心内或邻近。这些状态的标志基因通过ST和免疫组织化学显示一致的带状表达。总之，研究人员鉴定了推定的GB细胞转变：从发育星形胶质样到胶质增生再到缺氧状态，沿肿瘤扩展至缺氧和坏死的解剖轴展开。

为探索GB细胞转变，研究人员然后询问发育样和胶质增生-缺氧状态是否可在同一肿瘤亚克隆（即遗传相关的恶性亚谱系）内出现。首先，研究人员对多组学数据进行拷贝数畸变（CNA）推断，从肿瘤snRNA-seq和snATAC-seq谱联合调用克隆。以chr. 7和chr. 10拷贝数区分，大多数肿瘤亚克隆含有发育样和胶质增生-缺氧细胞，少数状态平均占每个克隆的15%（范围3%至49%）。虽然亚克隆倾向于显示相似的GB状态组成，三个肿瘤含有具有 divergent 状态的个体亚克隆。为在DNA水平识别CNAs和亚克隆，研究人员通过激光捕获显微切割（LCM）对100-200×100-200 μm大小的感兴趣组织区域（ROIs）进行WGS。研究人员在两个肿瘤（AT3、AT10）的两个采样位点分析了多个ROIs，产生61个高质量WGS谱。值得注意的是，AT10的一个ROI显示chr. 17p拷贝数丢失和chr. 17q获得，验证了研究人员的多组学拷贝数调用。研究人员然后基于LCM-WGS验证的拷贝数事件在多组学数据中定义肿瘤亚克隆。因此，配对多组学证据证明发育样和胶质增生-缺氧细胞状态的共享克隆起源。

接下来，研究人员检查GB亚克隆的空间组织以及每个亚克隆是否跨越发育样至胶质增生-缺氧TMs。在多组学数据中，研究人员在每个厘米级肿瘤采样位点内检测到许多亚克隆。不同采样位点显示基本一致的克隆组成。这些数据表明GB克隆的粗略空间混合。为研究更精细尺度的克隆组织，研究人员检查了LCM-WGS数据（约100×100 μm分辨率）。考虑到GB克隆混合且LCM切割跨越许多细胞，研究人员使用PyClone-VI基于单核苷酸变异（SNV）等位基因频率推断LCM ROIs的克隆群体结构。聚焦于AT3这一最全面分析的肿瘤，研究人员在35个ROIs中识别了14个SNV簇（即推定亚克隆）。个体SNV簇存在于多个LCM ROIs中，个体ROIs含有多个SNV簇，表明精细空间分辨率下的克隆混合。基于亚克隆组成对ROIs聚类揭示了跨越数毫米的广泛空间克隆域。推断AT3系统发育，研究人员观察到祖先、中间和晚期SNV簇之间的高度空间混合。个体克隆和克隆域跨越相邻Visium切片上解析的多种GB细胞状态和TMs。由于LCM-WGS数据集限于两个肿瘤，研究人员然后调查了整个Visium数据集的克隆组织。为解析Visium斑点内混合的GB亚克隆，研究人员开发了SpaceTree计算框架，利用scRNA-seq在ST数据中联合解卷积肿瘤亚克隆和细胞状态。SpaceTree通过多任务图神经网络架构结合标签传播整合参考scRNA-seq和查询ST数据集，实现scRNA-seq中注释的克隆和细胞状态的联合空间映射。研究人员在从GB snRNA-seq谱模拟的ST数据上对SpaceTree进行基准测试，发现其提供接近替代工具的空间克隆解卷积准确性，同时计算成本显著降低。SpaceTree揭示了所有肿瘤中亚克隆的广泛空间混合，量化为以恶性细胞和TMs为主的Visium斑点中的高克隆熵。SpaceTree还解析了与多种恶性细胞状态重叠的广泛空间亚克隆域。总之，研究人员提出了GB亚克隆空间架构的新框架，其中个体亚克隆精细空间混合并组织成跨越GB TMs的广泛克隆域。

鉴于其在单细胞和空间数据中的共享克隆起源，研究人员提出发育样细胞在GB快速扩展（每50天体积翻倍）过程中持续转变为胶质增生和缺氧状态，snRNA-seq图谱分析可捕获这种转变的不同阶段。为从snRNA-seq推断细胞轨迹，研究人员使用cell2fate——一种概率RNA速率模型。研究人员将cell2fate应用于个体肿瘤亚克隆的snRNA-seq谱，避免克隆和肿瘤间遗传差异的混杂，从58个亚克隆中的23个重建了稳健轨迹。大多数这些亚克隆（23个中的18个，超过78%）显示从发育样到AC-胶质增生-缺氧的时间转变，其余由个体状态主导且通常显示低转变评分。研究人员在九个肿瘤中的六个中观察到该轨迹，其中NPC-neuronal-like或OPC-NPC-like状态导向AC-胶质增生-缺氧。所有推定亚型的GB均显示这种转变，包括NPC-OPC-like富集的“proneural”、NPC-neuronal-like富集的“neural”和AC-胶质增生-缺氧富集的“classical-mesenchymal”肿瘤。在每个肿瘤内，许多亚克隆汇聚于该轨迹。因此，该轨迹在跨肿瘤亚型和遗传上不同的亚克隆中主导GB。接下来，研究人员检查该细胞轨迹是否在GB间分子保守，利用cell2fate识别的时间基因表达模块（即RNA速率模块）。研究人员识别了12个代表跨亚克隆和肿瘤反复出现的时间转录程序的元模块。发育样模块出现在轨迹早期，富集于发育样状态并共享其标志基因（如MBP、MYT1L）。相比之下，AC-胶质增生-缺氧模块出现在晚期，富集于AC-胶质增生-缺氧状态并具有各自的标志基因表达（如GFAP、SERPINE1、HILPDA）。一致地，在Visium ST数据中映射时，这些模块显示类似从发育样到胶质增生-缺氧细胞状态的空间转变。此外，生存分析显示富集晚期胶质增生-缺氧模块的患者预后更差，与不良“间充质样”GB预后一致。因此，该轨迹在GB间空间模式化且分子保守。为以正交方式验证GB轨迹，研究人员首先使用最广泛的LCM-WGS数据集（肿瘤AT3）中的体细胞突变重建GB克隆系统发育。这提供了基于SNV的克隆层级，比CNA推断更精细地解析克隆架构，研究人员然后将其与相邻Visium ST切片中映射的GB细胞状态相关联。研究人员聚焦于最祖先和最常见观察到的晚期SNV簇0和4。祖先SNV簇0的丰度与NPC-OPC-like细胞状态正相关并与AC-胶质增生-缺氧负相关，而晚期SNV簇4显示相反模式。这些数据与GB轨迹一致，沿此轨迹AC-胶质增生-缺氧细胞状态衍生自NPC-OPC-like细胞。为实验验证GB轨迹，研究人员将患者来源GB细胞系移植到患者来源肿瘤类器官中，并在原位追踪其群体水平细胞轨迹随时间的变化。首先，研究人员从原发性IDH-wt肿瘤衍生GB类器官（GBOs）。使用5,101-plex Xenium ST，研究人员观察到GBOs重现了GB细胞状态的空间转变，其中NPC-OPC-like状态位于最外周，AC-祖细胞样状态位于相对更深位置，胶质增生样状态围绕缺氧核心形成内环。第二，为追踪源自发育样GB细胞的细胞轨迹，研究人员表征了两个发育样患者细胞系E25和E30，用绿色荧光蛋白（GFP）报告基因标记并移植到GBOs中。在移植前（第0天，D0），scRNA-seq显示E25绝大多数由发育样状态组成（89.2% OPC/NPC-OPC-like），而E30是发育样（25.7%）和AC-胶质增生样细胞（48.1%）的混合。研究人员然后将E25和E30 GFP+细胞分别移植到3周龄GBOs中，并使用5,101-plex Xenium ST分析其时空轨迹直至D28。GBO移植后，发育样E25系产生AC-胶质增生-缺氧细胞。在D7和D14，移植细胞显示预期空间模式，其中OPC-NPC-like和AC-prog-like GFP+细胞位于最外周，胶质增生样GFP+细胞位于更深位置，缺氧GFP+细胞位于GBO核心。一致地，在E30移植中，发育样细胞减少而AC-胶质增生-缺氧状态随时间积累，呈现类似患者肿瘤的精细细胞转变。总之，研究人员识别并验证了GB间空间模式化且分子保守的恶性细胞轨迹。结合研究人员对AC-胶质增生-缺氧轨迹的精细映射，这些数据表明恶性细胞在整个肿瘤扩展过程中从发育样向胶质增生和缺氧状态的逐步转变。

最后，研究人员调查GB TME是否专门适应GB恶性细胞轨迹。研究人员聚焦于髓系细胞，鉴于其普遍性以及巨噬细胞衍生信号可改变GB恶性细胞状态。研究人员通过经典标志物、MSigDB基因集和胶质瘤髓系程序的表达注释了snRNA-seq图谱中的髓系亚簇。研究人员将11个髓系亚型（大多数为肿瘤相关巨噬细胞（TAMs））分为3个主要类别：（1）驻留和促炎髓系细胞（P2RY12、CX3CR1），涵盖小胶质细胞和抗肿瘤TAMs；（2）浸润和抗炎髓系细胞（CD163、STAB1、CD14），包括单核细胞和显示免疫抑制和促肿瘤特征的TAMs；（3）应激反应和血管生成TAMs，表达缺氧和血管生成（VEGFA、VCAN）以及“脂质负载”巨噬细胞（GPNMB、PLIN2）标志物。为精确将这些髓系细胞状态与GB状态相关联，研究人员检查了它们在GB TMs中的分布并观察到空间上不同的髓系区室。驻留和促炎群体富集于与发育样GB细胞（如OPC-like）重叠的“免疫（驻留）”TM。浸润和抗炎群体形成更接近AC-like和胶质增生过渡状态的独特“免疫（浸润）”TM。应激反应和血管生成TAMs高度富集于“胶质增生”和“缺氧”TMs。这些观察表明发育样和胶质增生-缺氧GB细胞状态具有不同的髓系微环境。为确定这些恶性状态是否暴露于不同的髓系信号，研究人员在空间共定位的TME和恶性状态之间进行细胞-细胞通讯（CCC）分析。该分析识别了跨GB细胞轨迹的独特髓系信号环境。在发育样TMs中，与促肿瘤和抗肿瘤功能相关的髓系配体如TRAIL（TNFSF10）、颗粒体蛋白前体（GRN）和半乳凝素9（LGALS9）推定信号传导至发育样状态。在胶质增生-缺氧TMs中，与创伤愈合、缺氧和血管生成相关的独特髓系配体如VEGFA、versican（VCAN）和膜联蛋白A1（ANXA1）推定靶向胶质增生和缺氧癌细胞。总之，髓系TME沿GB恶性细胞轨迹区域化，使恶性细胞暴露于不同信号。

讨论部分：GB异质性和可塑性阻碍了 pinpointing 癌细胞轨迹和开发靶向治疗的努力。本研究应用整体多模态映射方法联合表征GB肿瘤的遗传、细胞和组织架构。研究人员描述了GB显著的肿瘤内异质性和空间组织，扩展了先前的调查。然而，研究人员独特地将GB异质性和组织架构与一个从发育样向胶质损伤反应和缺氧状态的时空模式化癌细胞轨迹联系起来。该轨迹在推定GB肿瘤亚型和每个肿瘤内的亚克隆谱系间分子保守，并在体外GBOs中重现。此外，它与区域化髓系TME信号耦合。因此，该轨迹代表统一GB异质性的基本组织原则。多模态图谱促进了对GB癌细胞状态的生物学重新解释。值得注意的是，研究人员发现先前报道的间充质细胞状态实际上是恶性细胞胶质增生和缺氧反应。创伤愈合样状态和缺氧存在于包括胰腺癌和结肠癌在内的许多癌症中，表明发育样癌细胞向此类状态转变可能是保守的。除缺氧外，其他细胞和组织线索是否推动发育样癌症状态进入胶质增生仍有待确定。癌细胞的时空轨迹挑战了GB肿瘤分层为不同亚型。每个肿瘤内的区域异质性表明GB亚型（通常从单次活检分类）更代表区域特异性癌细胞状态和TMs。GB轨迹的时间性质可能构成另一挑战。富集发育样或胶质增生-缺氧状态的肿瘤可能分别代表GB的早期或晚期阶段，可能解释间充质GB的较差生存结果。遗传改变可促进GB间不同的癌细胞状态。虽然GB轨迹在肿瘤遗传层级间共享，研究结果也提出GB细胞状态可在遗传上不同的亚克隆内被调节的可能性。以chr. 17拷贝数事件与神经元样癌细胞状态的关联为例，需要功能研究来确定遗传改变是否能扩大肿瘤内异质性。研究人员识别了GB癌细胞亚克隆的多尺度空间架构。虽然GB亚克隆将肿瘤分割为广泛空间域，研究人员观察到它们在每个域内的密切空间混合。与乳腺癌和前列腺癌中克隆的空间分离形成对比，这种模式可能反映脑中缺乏可限制克隆扩增的物理屏障以及GB癌细胞的迁移性质。在一项 companion 研究中，研究人员利用此处生成的联合转录组和表观遗传数据定义和扰动控制GB可塑性的基因调控网络。除了识别GB状态的主调控因子外，这种正交方法提示GB癌症状态间的层级转变并重现了此处识别的GB轨迹。本研究有几个局限性。第一，虽然在类器官中追踪群体水平细胞轨迹，但未提供单癌细胞分辨率谱系追踪。第二，虽然研究人员检查原发性GB中癌细胞的主要细胞轨迹，但未探究其可塑性潜力。具体而言，先前研究和本研究未解决GB癌细胞是否能从胶质增生和缺氧回复为发育样状态。然而，companion 研究基于基因调控网络预测胶质增生-缺氧细胞的有限细胞状态转变，提出GB中超出此处所示轨迹的有限癌细胞可塑性的可能性。GB显著的肿瘤内异质性强调治疗干预的挑战。研究结果提出靶向癌细胞的时空轨迹和破坏与该轨迹相关的髓系TME——此处识别的GB肿瘤两个保守特征——作为潜在探索途径。