肉豆蔻（Myristica fragrans）膳食暴露经双向互交实验揭示果蝇（Drosophila melanogaster）生殖毒性的多层级评估

《Scientific Reports》：Multi-level assessment of Myristica fragrans-induced reproductive toxicity using reciprocal mating crosses in Drosophila melanogaster

　　

肉豆蔻（Myristica fragrans）是一种具有多种生物活性的常见烹饪香料，但其经膳食暴露后的生殖毒性研究鲜有报道。因此，本研究以黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）为模式生物，探讨了肉豆蔻粗提物的亚致死生殖毒性。研究人员通过饲料给予成年果蝇梯度浓度的提取物，以测定半数致死浓度（LC50）。在确定LC50后，利用双向互交实验、生殖组织透射电子显微镜（TEM）观察、气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析以及主要鉴定成分与特定生殖相关及抗氧化受体的分子对接，评估了亚致死效应。该提取物产生了浓度依赖性和时间依赖性的死亡率，LC50值从24小时后的0.041 mg/mL果蝇饲料降至72小时后的0.017 mg/mL果蝇饲料。更为重要的是，亚致死暴露显著降低了繁殖力，延缓了后代发育，并减少了成虫羽化率。TEM分析显示，卵巢和睾丸均出现显著的超微结构改变，其中雄性生殖组织表现出更高的敏感性。GC-MS分析鉴定出若干此前已被认为与生殖毒性相关的生物活性成分，而分子对接则预测了主要鉴定化合物与所选生殖及抗氧化相关受体之间具有良好的结合亲和力。这些研究结果表明，膳食暴露于M. fragrans提取物可对D. melanogaster的生殖功能产生不利影响，且该影响具有性别依赖性。

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一、研究背景与科学问题

肉豆蔻（Myristica fragrans Houtt.）是全球广泛使用的烹饪香料之一，尤其在东南亚、南亚、中东、欧洲和美洲地区消费量巨大。除烹饪和传统药用价值外，肉豆蔻已被报道具有抗氧化、抗炎和抗菌等生物活性。然而，越来越多的证据表明，肉豆蔻及其生物活性成分在特定暴露条件下也可能产生不良生物学效应。以往研究主要集中于肉豆蔻的神经毒性、行为影响、神经化学改变及代谢调节效应，而关于其生殖毒性的研究相对有限，且多聚焦于急性或亚慢性暴露在单一代内的即时效应。目前，亲代亚致死暴露于肉豆蔻对生殖性能及后代发育的后续影响仍知之甚少，尤其是母源与父源暴露对生殖毒性的相对贡献及其对生育力、胚胎存活率和后代发育的后果尚未得到充分表征。黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）因其世代周期短、生殖生物学特征明确且适用于受控双向互交设计，成为解决上述问题的理想模式生物。因此，本研究旨在通过双向互交策略，系统评估亲代亚致死暴露于肉豆蔻粗提物对果蝇生殖性能的影响，并整合超微结构、生化分析、化学组成鉴定及分子对接等手段，从多层级阐明其毒性机制。

二、研究设计与主要结论

研究人员以野生型Canton-S品系黑腹果蝇为实验模型，通过饲料途径给予不同浓度的肉豆蔻正己烷粗提物，首先测定了24、48和72小时的半数致死浓度（LC₅₀），随后以72小时LC₂₀（0.01 mg/mL）作为亚致死暴露浓度，采用双向互交实验区分雄性和雌性亲代暴露对生殖结局的独立贡献。研究结果表明，亚致死暴露于肉豆蔻提取物可显著损害果蝇的生殖性能，且涉及雄性和雌性生殖组织超微结构改变、氧化应激失衡以及多种生物活性成分与生殖相关蛋白的潜在分子相互作用。值得注意的是，涉及处理雄蝇的杂交组合在产卵量降低、发育周期延长和成虫羽化率下降等多项生殖终点上表现出更为显著的影响，提示雄性介导的生殖效应在某些终点上更为突出。该研究首次系统整合了行为学、超微结构、生化和计算模拟等多层级证据，揭示了日常消费香料中亚致死剂量暴露的潜在生殖风险，具有重要的毒理学意义。

三、主要技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：毛细管摄食实验（CAFE）评估处理对果蝇取食量的影响；毒性生物测定结合概率分析（Probit analysis）确定LC₂₀和LC₅₀值；双向互交实验区分亲代性别特异性贡献；透射电子显微镜（TEM）观察卵巢和睾丸超微结构变化；生化试剂盒检测氧化应激标志物，包括丙二醛（MDA）、细胞色素P450（CYP450）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）；气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析提取物化学组成；以及AutoDock Vina分子对接分析主要植物化学物与蜕皮激素受体（EcR）、谷胱甘肽S-转移酶S1（GstS1）、ATP依赖性RNA解旋酶Vasa、Ras相关蛋白Rab5和卵黄受体Yolkless（Yl）等靶蛋白的结合亲和力。实验所用果蝇品系（Canton-S；stock no. 64349）购自美国印第安纳大学Bloomington果蝇库存中心。

四、研究结果

肉豆蔻提取物对食物消耗的影响

通过毛细管摄食实验发现，食物消耗量受性别与提取物浓度的交互作用显著影响。雄性果蝇在0.02和0.03 mg/mL浓度下食物消耗显著增加，而雌性果蝇在各测试浓度下均无显著变化，表明观察到的生殖效应并非由摄食抑制或营养剥夺所致。

肉豆蔻粗提物对果蝇存活率的影响

肉豆蔻粗提物诱导成年果蝇产生显著的浓度依赖性和时间依赖性死亡。72小时暴露后，最低浓度（0.01 mg/mL）死亡率达18%，最高浓度（0.035 mg/mL）死亡率达86%。概率分析估算的LC₅₀值从24小时的0.042 mg/mL降至72小时的0.017 mg/mL，且概率模型拟合良好。

肉豆蔻提取物亚致死浓度对果蝇生活史性状的影响

以LC₂₀预暴露后，所有处理组的产卵量均显著低于对照组。处理雌蝇与未处理雄蝇杂交（T1）平均产卵9.52枚/雌，而未处理雌蝇与处理雄蝇杂交（T2）仅产3.12枚/雌，双亲均处理组（T3）为2.88枚/雌，表明雄性暴露对产卵量的影响强于雌性单独暴露。T3组无卵孵化，因此发育时间仅评估了对照组、溶剂组、T1和T2组。卵到幼虫的发育时间无显著差异，但卵到蛹和卵到成虫的发育时间显著延长，其中T2组成虫羽化时间最长（15.6天）。T1和T2组的成虫羽化率均显著低于对照组，但两者之间无显著差异。

TEM检查

透射电镜显示，处理雌蝇卵巢的滤泡层显著增厚、电子密度降低且结构松散，滤泡上皮膜不规则，卵黄颗粒和脂滴丰度显著降低，单个脂滴面积显著减小，提示卵黄沉积和脂质储存动态改变。处理雄蝇睾丸中，精子束内精母细胞数量显著减少，轴丝排列不规则，线粒体（nebenkerne）肿胀且嵴结构紊乱，细胞质出现空泡化，提示线粒体应激和早期退化，可能通过氧化损伤和膜破坏机制对睾丸细胞产生细胞毒性效应。

果蝇暴露于肉豆蔻粗提物后的生化反应

亚致死暴露显著改变了氧化应激生物标志物：MDA水平从0.51升至2.09 nmol/mg蛋白，细胞色素P450浓度从4.487升至6.507 pg/mg蛋白，而SOD活性从6.01降至2.92 U/mg蛋白，CAT活性从38.47降至27.10 U/mg蛋白。MDA升高表明脂质过氧化增加，P450升高反映解毒系统激活，而SOD和CAT降低提示抗氧化防御受损，整体呈现氧化应激失衡状态。

肉豆蔻正己烷粗提物的化学成分

GC-MS分析共鉴定出49种化学成分。含量最高的化合物为榄香素（Elemicin，13.92%），其他主要成分包括α-(1-(2,6-二甲氧基-4-(2-丙烯-1-基)苯氧基)乙基)-3,4,5-三甲氧基苯甲醇（9.97%）、肉豆蔻酸（9.88%）、1-乙酰基-5,5-二苯基咪唑烷-4-酮（8.7%）、4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯基异戊酸酯（8.57%）、肉豆蔻醚（Myristicin，6.96%）、4,6-二溴二苯并呋喃（6.11%）、(S)-5-烯丙基-1,3-二甲氧基-2-((1-(3,4,5-三甲氧基苯基)丙-2-基)氧基)苯（5.4%）等。

分子对接方案的验证

通过将参考配体重新对接至各靶蛋白结合口袋进行方案验证，所有重对接配体的均方根偏差（RMSD）值均低于1.0 ?，表明预测构象与参考构象高度一致，确认了对接方案的可靠性。对于无实验解析配体结构的Yl受体，采用P2Rank预测推定配体结合口袋，并通过50次独立对接运行评估构象可重复性。

肉豆蔻植物化学物的分子对接

分子对接分析显示，多种肉豆蔻来源的植物化学物对所选果蝇靶蛋白具有良好结合亲和力。4,6-二溴二苯并呋喃与EcR结合最强（?8.04 kcal/mol）；1-乙酰基-5,5-二苯基咪唑烷-4-酮对GstS1（?7.38 kcal/mol）、Rab5（?7.71 kcal/mol）和Yl（?8.04 kcal/mol）均表现出最高亲和力；α-(1-(2,6-二甲氧基-4-(2-丙烯-1-基)苯氧基)乙基)-3,4,5-三甲氧基苯甲醇与Vasa结合最强（?8.85 kcal/mol）。这些预测的相互作用为观察到的表型改变提供了合理的分子机制解释。

五、讨论与结论

讨论部分指出，涉及处理雄蝇的杂交组合在多个生殖终点上表现出更显著的影响，这可能与精子发生过程对毒性和氧化应激的更高敏感性有关。精子发生是持续且高度活跃的过程，涉及连续的 mitotic 和 meiotic 分裂，使发育中的生殖细胞特别容易受到毒性损伤。相比之下，卵子发生发生在特化的卵巢微环境中，滤泡细胞提供的结构和代谢支持可能在一定程度上保护卵母细胞免受短暂化学应激的影响。超微结构观察进一步支持了这些生殖效应：卵巢中滤泡层增厚和卵黄/脂滴减少提示卵黄沉积和脂质储存紊乱，而睾丸中精母细胞数量减少、线粒体肿胀和细胞质空泡化则提示精子发生受损。生化分析表明，MDA和细胞色素P450升高伴随SOD和CAT降低，表明氧化损伤增加与抗氧化防御受损并存，为生殖组织细胞改变提供了合理解释。GC-MS鉴定出的多种成分（如榄香素、肉豆蔻酸和肉豆蔻醚）此前已被报道与生殖和发育毒性相关。分子对接结果则提示，多种肉豆蔻植物化学物可能同时干扰蜕皮激素信号、抗氧化防御、生殖系维持和内吞通路等多靶点通路，共同促成观察到的发育延迟、氧化应激、精子发生受损和卵子发生紊乱。

研究结论指出，本研究提供了肉豆蔻可通过相互关联的生物学、超微结构和生理学效应发挥亚致死生殖毒性的证据，且某些生殖终点在处理雄蝇中表现出更显著的影响。这些发现得到了生化改变及其生物活性成分与所选靶蛋白预测相互作用的支持，为这些效应背后的可能机制提供了见解。研究结果强调了考虑常见消费香料中生物活性化合物在重复或持续暴露条件下的生殖后果的重要性。食物消耗量未减少进一步表明，这些效应并非主要归因于摄食驱避或营养剥夺。