热自组装机制及无需试剂的牛血清白蛋白纳米粒子的胶体稳定性

《International Journal of Biological Macromolecules》：Thermal self-assembly mechanisms and colloidal stability of reagent-free bovine serum albumin nanoparticles

　　• BSA纳米颗粒是通过完全水相、无试剂的热化学方法合成的。• 温度、孵育时间和浓度系统地调节了BSA-NPs的大小和稳定性。• 在70℃下，产生了胶体稳定、低聚集度、尺寸较小（约10–20纳米）的BSA-NPs。• 在80℃下，由于蛋白质的广泛展开，形成了相互连接的较大聚集体。• 这种绿色、无化学试剂的合成方法为蛋白质纳米材料的制备提供了一个可持续、可靠且可控的平台。

引言
天然聚合物是存在于自然环境中的有机化合物，作为开发用于医疗和生态领域的生物材料的合适且多功能的载体[1],[2]。在研究用于生产天然聚合物的各种材料中，蛋白质因其独特的性质以及可以被工程化以实现特定功能的潜力而引起了极大的兴趣。因此，近年来人们对基于蛋白质的生物聚合物在多种应用中的兴趣逐渐增加；蛋白质代表了推动创新技术驱动的医疗和生态系统发展的有利前沿[1],[3]。基于蛋白质的载体已经被记录为微胶囊、水凝胶、前药、药物缀合物和三维支架。蛋白质纳米颗粒（PNPs）因其生物相容性、可生物降解性和最小的免疫原性而与其他纳米载体区分开来[4],[5]。多种蛋白质，如明胶、白蛋白、胶原蛋白、玉米醇溶蛋白、麦谷蛋白、丝蛋白和大豆蛋白，已被用于PNPs的制备[1],[6]。白蛋白是一种高溶解度的蛋白质，在pH值为4到9的范围内能够保持其生物活性。它的三维结构同时包含亲水区和疏水区以及带电的氨基酸，这使其能够运输具有不同物理化学特性的药物[7],[8]。此外，白蛋白表面的氨基和羧基团可作为聚合物或配体的结合位点。另外，由于白蛋白的丰富可得性、无毒性质、可生物降解性以及其在肿瘤和炎症组织中优先积累和吸收的特性，它成为药物递送系统的理想候选物[9],[10]。白蛋白还表现出广泛的催化活性，目前被认为是一种多功能生物催化剂；因此，它既适用于环境应用也适用于催化应用[11]。卵清白蛋白（OVA）来自蛋白，与人类血清白蛋白（HSA）和牛血清白蛋白（BSA）一起，代表了三种不同类型的白蛋白，它们已被提取并用于多种生物医学用途[12]。牛血清白蛋白（BSA）是一种66.4 kDa的球状蛋白质，由583个氨基酸组成，通过17个二硫键稳定，在pH值为4.7时具有等电点[13]。其天然二级结构主要以α螺旋为主，据报道其螺旋度约为66%[14]；在中性pH值下，当温度超过约30℃时，这种α螺旋含量会减少，同时β结构和无序结构的含量会增加[15],[16]。BSA在中性pH下的变性温度（Td）在60–64℃之间，蛋白质在40–50℃内保持其天然构象，在约52–60℃以上会发生不可逆的展开[17]。根据实验条件和方法的不同，BSA展开的标准吉布斯自由能（ΔG°）范围在约64–267 kJ/mol之间[18]，反映了其天然折叠的中等热力学稳定性。尽管如此，BSA被认为与其人类对应物相似，并且可以以低成本获得高纯度。此外，由于对BSA的过敏反应在人类中相当罕见，因此其安全性较高[11]。这些因素解释了为什么BSA比来自其他来源（如HSA）的白蛋白受到更广泛的研究[11]。因此，选择BSA作为本研究的模型蛋白质，是因为其具有良好表征的中等热稳定性，为研究受温度控制的自我组装提供了一个可重复且实验上易于处理的窗口。由于其变性温度位于一个容易实现的范围内（60–64℃），可以在50–80℃的孵育温度下检查蛋白质的天然状态、部分展开状态和完全变性状态，而无需极端条件。其单一的、明确的等电点和已知的pH依赖性电荷行为进一步使得基于静电相互作用的自我组装在实验上易于解释。所有这些因素使得BSA成为探索热展开、胶体稳定性和纳米颗粒形成之间关系的实用且生理相关的模型。

近年来，在生物医学和食品工程领域越来越多地探索BSA-NPs的应用。在生物医学应用中，它们被用于癌症治疗、免疫调节、酶固定、控释系统、生物成像和诊疗一体化[19]，以及抗病毒药物递送，包括一种用于抑制SARS-CoV-2复制的BSA包覆纳米颗粒系统[20]。在食品工程中，BSA广泛用作乳化剂、发泡剂和凝胶剂，稳定食品系统，并有助于获得理想的质地和口感，同时作为功能性食品中生物活性化合物的负载和递送载体[21]。

BSA纳米颗粒（BSA-NPs）的合成具有良好的成本效益，并遵循简单的方法，可以根据需要调整以实现所需的尺寸分布[22]。BSA-NPs的合成主要通过两种技术实现：高压均质化（HPH）和脱溶，尽管也有其他方法可供选择[23],[24]。通过HPH制备的BSA-NPs是通过强烈的剪切力形成的纳米乳液，这会暂时改变BSA蛋白质的三级结构。这种方法广泛用于蛋白质或蛋白质缀合物药物的工业生产[25]。然而，与该技术相关的严格条件可能会导致蛋白质的部分永久性变性，从而可能降低其生物活性[26]。脱溶技术涉及将水溶液中的蛋白质与脱溶剂（通常是酒精、丙酮或类似的有机溶剂）结合，在这种条件下蛋白质不会溶解。这一过程会导致小蛋白质聚集体的形成和随后的生长[12]。然而，使用酒精（乙醇）或丙酮等溶剂并不被认为对环境可持续。报告指出，在药物合成过程中，溶剂的质量占比超过56%，其中水占32%，反应物仅占7%[27]。这突显了工业操作中使用的溶剂量很大。此外，旨在去除纳米颗粒合成后杂质的洗涤步骤会产生水和有机废物的混合物[28]。这些溶剂可能会由于污染水和空气而对人类和动物的神经系统、血液系统、肾脏、呼吸系统、眼睛和生殖系统造成健康问题[29]。常用戊二醛作为交联剂辅助脱溶，以防止脱溶后的BSA纳米颗粒聚集和重新分散，通常产生的颗粒尺寸在80–210纳米范围内，具有良好的多分散性控制[19],[23]。然而，戊二醛交联会对表面氨基团引入额外的化学修饰，并且已知具有细胞毒性，因此正在探索其他交联剂，如葡萄糖、柠檬酸和单宁酸[30],[31]。无论选择哪种交联剂，这种方法仍然需要一个初始的有机脱溶步骤，从而加剧了与溶剂和交联剂废弃物相关的环境和生物相容性问题。相比之下，这里采用的热驱动自我组装方法可以在不使用任何有机溶剂或化学交联剂的情况下实现纳米颗粒的形成和胶体稳定，而是依靠BSA在受控热条件下的内在静电、疏水及特异性相互作用[32]，提供了一种相对简单且更环保的替代方案，尽管尺寸控制受温度、浓度和孵育时间的影响，而不是溶剂/交联剂的比例。

先前已有针对白蛋白和其他蛋白质的类似基于自我组装和热化学方法的研究，展示了这类绿色策略在生物医学和环境应用中的潜力[33],[34]。然而，这些方法通常仍需要额外的化学试剂来驱动或稳定自我组装——例如，尿素和Tris缓冲液与透析步骤结合[33]、香草精[35]或麦芽糖[34]，或磷酸盐缓冲介质中的非离子表面活性剂[36]——分别作为变性剂、天然交联剂、糖基化剂或表面活性剂驱动的组装剂。相比之下，本研究仅使用中性pH下的去离子水就实现了BSA-NPs的形成和长期胶体稳定性，整个合成过程中不使用任何额外的试剂、溶剂、缓冲液或稳定剂。基于这些先前的研究，我们进一步提供了在四种温度、四种蛋白质浓度和两种孵育时间下纳米颗粒形成的系统图谱，以及对胶体稳定性进行了4周的监测——这是早期报告中未涉及的范围——提供了一种更简单、更环保的合成路线，并为未来的应用特定优化提供了更完整的结构-性质数据集。

材料与方法
购买了纯度为98%且不含脂肪酸的BSA（Wako公司，FujiFilm Wako Pure Chemical Corporation，日本大阪）。所有制备过程中使用的是去离子水（ELGA LA621，英国；pH值约为7）。

BSA-NPs的形成和尺寸分布
为了验证BSA-NPs的形成并检查其尺寸分布，采用了动态光散射（DLS）和紫外-可见光光谱法（UV–vis spectrophotometry）。在任何测试条件下，热孵育前后溶液的pH值均未观察到明显变化。首先进行了系统的合成参数筛选，以评估温度（50、60、70和80℃）和BSA浓度（0.25、0.5、0.75和1 mg/mL）对BSA-NPs形成的影响。在较低温度（50和60℃）下，没有观察到明显的……

讨论
本研究中使用的实验条件——温度为50–80℃，蛋白质浓度为0.25–1.0 mg/mL，孵育时间为30和60分钟——是基于BSA在中性pH下的报告变性温度（Td）约为60–64℃[17]来选择的。因此，50℃接近天然状态，60–70℃涵盖了部分可逆展开的过渡区域，80℃则超过了Td，处于更广泛的变性状态。

结论
本研究提出了一种环保的、完全水相的策略，通过无试剂的热自我组装来合成BSA-NPs。结果提供了关于温度、孵育时间和蛋白质浓度在调节BSA-NPs的大分子组装、物理化学性质和结构演变方面的初步描述性见解。综合使用DLS、UV–Vis光谱法和场发射扫描电子显微镜（FESEM）分析表明，较高的蛋白质浓度和适度的热处理……