印度东北部米佐拉姆邦发现的Ophiophagus hannah蛇毒的蛋白质组学、生物化学及体内毒理学特性研究

《International Journal of Biological Macromolecules》：Proteomic, biochemical, and in vivo toxicological characterization of Ophiophagus hannah venom from Mizoram, Northeast India

　　

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  对Ophiophagus hannah（汉娜王蛇）毒液（OHV）的蛋白质组学分析发现了来自16个家族的45种毒素异构体。
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  三指毒素和磷脂酶A₂是最丰富的非酶蛋白和酶蛋白。
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  OHV的致死剂量（50%）为0.98毫克/千克，它对小鼠具有神经毒性和病理变化作用。
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  OHV具有抗凝血作用，并且会导致小鼠足部水肿。

引言

蛇咬伤中毒仍然是一个主要但被忽视的全球健康问题。根据世界卫生组织（WHO）的数据，每年有81,000至138,000人死于蛇咬伤，而几乎三倍的人数因此不得不截肢或终身残疾。有毒蛇咬伤会引起急性医疗紧急情况，包括瘫痪、出血以及对肺、脑、肝和肾等重要器官的损伤，并导致严重的局部组织损伤，如果不进行治疗，这些损伤可能是致命的[1]、[2]、[3]。通过及时获得安全有效的特定物种抗蛇毒血清，大多数这些后果是可以预防的。

尽管蛇咬伤具有破坏性影响，但在2017年之前，它们在全球健康讨论中一直被忽视。自那时起，已经实施了各种策略，目标是在2030年前将全球蛇咬伤死亡率降低50%。印度是世界上蛇咬伤死亡人数最多的国家，每年约有56,000人因此丧生，大约是艾滋病导致死亡人数的两倍[4]。受害者主要来自农村贫困地区，主要是农民和低收入群体。

印度的大多数蛇咬伤病例是由“四大毒蛇”造成的，即印度眼镜蛇（Naja naja）、Russell viper（Daboia russelii）、普通游蛇（Bungarus caeruleus）和锯鳞 viper（Echis carinatus）。这四种蛇的毒液蛋白质组组成和药理特性已经得到了详细研究。相比之下，印度其他一些具有医疗重要性的蛇的毒液组成和药理特征，特别是那些来自印度东北部（NE）的蛇，仍然基本上没有得到研究，它们的毒液没有被用于商业抗蛇毒血清的制造[1]。这些蛇包括各种眼镜蛇、游蛇、蝰蛇和海蛇；因此，被这些蛇咬伤的患者往往得不到足够的治疗，这导致了该国的蛇咬伤死亡率[5]。重要的是要认识到，除了其有害作用外，蛇毒还含有多种生物活性分子，可以作为治疗分子的来源，研究蛇毒的组成可能会发现拯救生命的药物原型。

尽管印度汉娜王蛇（Ophiophagus hannah）的毒液产量高且分布于南亚和东南亚地区（图1），但其毒液组成却被忽视了。这种蛇最初由Cantor在1836年描述为Hamadryas hannah，后来由Günther在1864年重新分类到Ophiophagus属。汉娜王蛇并非真正的Naja物种，而是与曼巴蛇（Dendroaspis）有更接近的进化关系。以前分布广泛的O. hannah现在仅限于印度北部和东部地区，另外还发现了三种新的物种，即O. bungarus（巽他岛）、O. kaalinga（西高止山脉）和O. salvatana[6]。汉娜王蛇分布在整个印度东北部的森林地区，包括阿鲁纳恰尔邦、阿萨姆邦、曼尼普尔邦、梅加拉亚邦、米佐拉姆邦和锡金邦。它们平均体长可达10到11英尺，栖息地多样，包括林地、竹林、红树林和农业用地；然而，快速的森林砍伐导致栖息地丧失，迫使它们靠近人类居住区并在家中寻找食物，从而可能引发意外咬伤。尽管如此，关于印度东北部地区蛇咬伤的流行病学、毒液组成和毒液引起的药理效应的数据仍然非常匮乏。尽管汉娜王蛇在临床上的重要性，但尚未对该地区的OHV种群进行研究，包括对其毒液组成和药理特性的分析，这些对于理解中毒的毒理学、毒液组成的地理变异以及开发有效的抗蛇毒血清至关重要。

对印度以外的地区的O. hannah毒液（OHV）的研究揭示了其毒液组成，并表明OHV会导致严重的局部组织损伤和全身性神经毒性，常常导致呼吸衰竭[7]。然而，蛇毒的组成及其药理效应和临床表现受到生态、地理和发育因素的影响，导致种间和种内存在显著差异[8]、[9]。对西高止山脉种群的研究表明，OHV主要由低分子量的三指毒素（3FTxs）组成，主要是α-神经毒素，以及富含半胱氨酸的分泌蛋白（CRISP）、磷脂酶A₂（PLA₂）和蛇毒金属蛋白酶（SVMP）[10]。对印度尼西亚和马来西亚的OHV的研究表明，3FTxs是毒液的主要成分，其次是SVMP；然而，OHV组成的差异导致了它们药理效应和致死性的显著差异。例如，中国地区的OHV对小鼠的致死性更强，而对蜥蜴的致死性更强，这突显了毒液组成如何适应当地猎物的生态特点[11]。此外，不同地理区域的OHV之间LD₅₀的显著差异进一步强调了这种组成差异[12]。因此，我们预计印度东北部的OHV在组成、药理特性和致死性上也会有所不同，只有通过对其毒液的全面研究才能阐明这些差异。

本研究旨在阐明印度东北部OHV的蛋白质组（毒素组）组成及其生化和药理特性，并将毒液蛋白质组（毒素）组成与小鼠中毒后的体外和体内病理生理学联系起来。我们对印度及以外地区的OHV进行了比较分析，以阐明米佐拉姆地区OHV药理特性的差异，并提出可能的解释。

章节摘录

材料与方法

OHV是从米佐拉姆大学校园内的三条野生成年雄性蛇（平均长度10.3至10.5英尺）中收集的，校园范围内的经度介于92° 38′ 39″ E到92° 40’ 23″ E之间。其中一条蛇由作者HTL进行了分类鉴定和采毒。收集毒液前已获得Aizawl野生动物管理员的许可（许可证编号：B.19060/1/2024-MSSB/Vol II/38）。通过离心去除细胞碎片后，毒液被冻干

OHV的生化特性

表1显示了OHV的酶活性，包括PLA₂、SVMP、ATP酶和其他检测到的酶活性。在 crude OHV 中未检测到可测量的透明质酸酶活性，这可能是由于透明质酸酶的相对含量较低（0.06%），导致其活性低于检测方法的检测阈值。因此，通过SDS-PAGE分析，10微克的OHV能够有效降解纤维蛋白原和纤维蛋白（图2A和B）。

定量蛋白质组数据与OHV蛋白（毒素）的SDS-PAGE条带强度吻合良好

在LC–MS/MS分析之前分解毒液蛋白质有助于更全面地表征毒液蛋白质组，提高蛋白质的检测率和覆盖率。虽然所有分解技术都能揭示蛋白质/肽的组成，但仍可能出现轻微差异[39]。通过还原SDS–PAGE分离毒液蛋白质，然后对单个凝胶条带进行LC–MS/MS分析，是一种简单、经济且可靠的方法。

结论与未来方向

本研究首次全面分析了印度东北部（米佐拉姆）的OHV，阐明了其蛋白质组组成和毒理学特性。毒液来自三条成年雄性蛇，然后进行了一次SDS-PAGE分析。分析表明，毒液富含非酶成分如3FTx和酶成分如PLA₂，这些成分是OHV引起凝血异常的基础。研究还揭示了毒液组成的差异

CRediT作者贡献声明

Priyanka Gogoi:撰写——原始草稿、方法论、调查、正式分析、数据管理。Sneha Deb:撰写——审阅与编辑、调查、正式分析、数据管理。Debosmita Sen:调查、正式分析。Rahul Kumar:调查、正式分析、数据管理。H.T. Lalremsanga:资源支持。Ashis K. Mukherjee:撰写——审阅与编辑、方法论、调查、资金筹集、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

Sneha Deb感谢印度科学技术部生物技术司通过DBT-JRF计划提供的初级研究奖学金。作者还要感谢IASST主任和IASST的SAIC提供了实验室和仪器设施；Guwahati的IASST动物房设施、Salima Siddika博士、R. Mahato女士和S. Baruah博士在动物实验中的帮助，以及M. Vanlalchhuana在毒液方面的支持

Priyanka Gogoi|Sneha Deb|Debosmita Sen|Rahul Kumar|H.T. Lalremsanga|Ashis K. Mukherjee