《International Journal of Biological Macromolecules》：Structural basis for saccharide binding by human RNase 2/EDN: Insights into its potential lectin-like properties
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人RNase 2属于RNase A超家族，该家族成员参与宿主防御，除具有催化性核糖核酸水解作用外，还被报道具有多种生物学特性。RNase 2又称嗜酸性粒细胞来源神经毒素（EDN），是嗜酸性粒细胞分泌颗粒中储存的主要蛋白之一。本研究报道了EDN与多种单糖衍生物、
人RNase 2属于RNase A超家族，该家族成员参与宿主防御，除具有催化性核糖核酸水解作用外，还被报道具有多种生物学特性。RNase 2又称嗜酸性粒细胞来源神经毒素（EDN），是嗜酸性粒细胞分泌颗粒中储存的主要蛋白之一。本研究报道了EDN与多种单糖衍生物、两种二糖及三种羧酸阴离子的复合物结构，均通过X射线晶体学（MX）在原子分辨率下解析。研究人员在蛋白质表面鉴定出两个阴离子结合位点（A1、A2）和七个糖结合位点（S0-S6）。结果表明，葡萄糖、半乳糖和岩藻糖主要结合于邻近A1位点的S1位点；β-甘露糖结合于S0位点，α-甘露糖结合于S2和S3位点；岩藻糖另结合于S4位点；唾液酸（N-乙酰神经氨酸）结合于S2、S4和S5位点；N-乙酰葡糖胺和蔗糖结合于S6位点。基于晶体学表征，研究人员提出了EDN糖类识别的多位点表面架构。分子对接研究再现了实验观察到的单糖结合模式，并预测了二糖和七糖的潜在结合方式。电泳迁移率变动分析和活性染色凝胶证实EDN与肝素结合并可被该糖胺聚糖抑制其核糖核酸酶催化活性。该研究首次提供了RNase 2与糖类复合物的三维结构，为理解其潜在凝集素样特性提供了结构基础，对探究嗜酸性粒细胞RNase在宿主防御和免疫调节中的功能具有重要意义。
研究背景方面，人RNase 2（EDN）是RNase A超家族成员，与RNase 3（ECP）约70%同源，二者在灵长类进化中经基因复制产生。EDN储存于嗜酸性粒细胞分泌颗粒中，其表达受病毒感染触发，已被提议作为高炎症状态和血液疾病的生物标志物。RNase A家族中部分两栖类成员（如蛙源唾液酸结合凝集素cSBL）早年以碳水化合物结合蛋白被分离，被称为"leczyme"，兼具糖结合与RNase催化活性，其凝集素特性与抗肿瘤作用相关。然而，哺乳动物RNase A家族成员的糖结合特性尚缺乏结构表征。既往研究报道EDN与ECP对肝素具有高亲和力，主要由表面精氨酸残基与糖胺聚糖（GAG）阴离子基团间的静电相互作用介导；肝素七聚体是EDN细胞结合的最有效抑制剂。近期糖基化RNA的发现重新激发了对RNase潜在糖结合能力的兴趣。本研究旨在通过X射线晶体学解析EDN与多种糖类的复合物结构，阐明其糖类结合模式，为理解其潜在凝集素样特性提供结构依据。
关键技术方法方面，研究人员利用大肠杆菌表达系统重组表达EDN蛋白，经包涵体溶解、复性与阳离子交换层析纯化获得高纯度蛋白。采用坐滴气相扩散法进行结晶筛选，优化后获得衍射至原子分辨率（0.94-1.3 ?）的晶体。通过晶体浸泡法将单糖、二糖及羧酸阴离子引入蛋白晶体，在ALBA同步辐射光源XALOC BL13线站收集衍射数据，经autoPROC流程处理、Phenix精修解析复合物结构。利用AutoDock Vina-Carb进行分子对接模拟，以电泳迁移率变动分析（EMSA）和活性染色凝胶评估EDN与肝素的结合及酶活性抑制。
研究结果方面，第一，新型阴离子结合位点的鉴定。研究人员在筛选结晶条件时获得了EDN与乙酸、丙二酸、酒石酸和柠檬酸等羧酸阴离子的复合物结构。所有阴离子分子主要聚集于一个独特位点A1，由T46、N50、V54、G75、S76、V78和Y107残基构成，T46和Y107侧链羟基与羧酸基团形成保守氢键。值得注意的是，乙酸在纯化和脱盐后仍牢固结合于A1位点，表明EDN对该阴离子具有强亲和力。此外还发现第二个阴离子结合位点A2，由Q14、H15、K38、H129和L130构成，与蛋白催化活性中心口袋共定位。第二，EDN新型糖结合位点的鉴定。研究人员通过晶体浸泡成功获得了EDN与葡萄糖、岩藻糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰胞壁酸和唾液酸的原子分辨率复合物结构。葡萄糖、半乳糖和岩藻糖主要结合于邻近A1位点的S1位点，O6羟基与Q77主链羰基氧形成氢键，O1羟基与相邻阴离子盐的羧基相互作用，L45、V78和P79通过疏水作用稳定结合口袋。β-甘露糖结合于S0位点（L45、P79、I81、P102提供范德华接触），α-甘露糖结合于S2位点（H72和N59形成氢键）。MAN-2、FUL-3和TRE在S3位点重叠，由R68和N70提供氢键，A110和H129参与疏水结合，该位点与嘌呤结合位点B2部分重叠。α-岩藻糖结合于S4位点，SLB-4亦结合于此。SLB-1、SLB-3和MUB共享S5位点，该位点与嘧啶结合位点B1及p-1位点部分重叠，R132与SLB-1的C6二醇基团羟基形成特异性相互作用。NAG和SUC共享S6位点。总体而言，研究人员提出了7个糖结合口袋，以S1为主参考位点。进化分析表明，S0、S1、S6和A1为EDN独有位点，S4和S5为EDN与ECP共享位点，S2、S3和A2为与其他家族成员共享位点。第三，寡糖结合的建模研究。分子对接结果显示，各单糖配体在相应蛋白口袋的对接结果大多再现了实验观察到的结合模式，预测结合亲和力在-3至-5 kcal/mol范围内。S2、S3、S5和S6口袋聚集于蛋白同一面，提示该侧具有更高的碳水化合物结合位点密度。二糖对接预测结合亲和力略优于单糖。七糖对接模型主要聚集于S2、S3和S5位点区域，但受限于七个糖结合口袋间距大于相邻糖残基典型间距，单一寡糖难以同时覆盖所有位点。
讨论部分总结，本研究首次基于X射线晶体学数据提出了人RNase 2/EDN的7个推定糖结合位点，共定位17个配体于7个保守位点。A1阴离子位点在EDN和ECP中具有独有特征，在其他RNase A家族成员中未发现。S1位点邻近A1，是EDN最特征性的区域。EDN可结合多个唾液酸分子，S5位点中SLB的羧酸基团与R35、R68和R132三个阳离子残基形成稳定相互作用，这些残基经ConSurf分析鉴定为RNase 2序列特异性残基。与蛙源凝集素RNase cSBL的结构比较揭示了保守与非保守特征。EDN糖结合位点与先前描述的酶-底物结合位点存在部分重叠。需要注意的是，当前EDN糖结合模式不符合凝集素中已描述的任何经典碳水化合物识别结构域（CRD）基序，复合物中无金属离子参与，不属于经典C型CRD类别。糖基化RNA的发现为细胞免疫调节提供了新的复杂性层面，邻近RNase活性位点的糖结合位点可能有助于蛋白靶向细胞表面暴露的糖基化RNA。研究结论翻译：本研究基于MX提出了EDN蛋白表面的7个糖结合口袋。然而不能忽视大分子晶体学的固有局限性，特别是通过晶体浸泡获得蛋白复合物时，该方法将配体结合限制于现有晶格中，蛋白堆积可约束其局部构象 mobility并影响配体可及性。因此观察到的EDN-糖结合模式不能完全反映蛋白在溶液中的构象灵活性和结合可及性。后续工作必须以生物物理表征和溶液功能实验来佐证当前结构数据，还需高通量筛选实验以发现EDN在生理条件下的相关糖配体。最终，发现EDN体内的潜在糖伴侣将对新型疗法开发具有重要价值。
