拟南芥（Arabidopsis thaliana）线粒体钙摄取蛋白的结构研究

《International Journal of Biological Macromolecules》：Structural studies of mitochondrial calcium uptake protein from Arabidopsis thaliana

　　

摘要

线粒体钙单向转运蛋白（MCU）负责将Ca²⁺转运到线粒体基质中，并在线粒体的多种功能中发挥关键作用。在后生动物中，MCU的活性受到调节性线粒体钙转运蛋白（MICU）和EMRE的共同调控。然而，大多数陆地植物缺乏可识别的EMRE同源物，因此必须通过其他机制来调节这种单向转运蛋白，尽管目前还没有关于任何植物MICU的结构信息。拟南芥是一种模式植物，其AtMCU和AtMICU的功能已经被广泛研究。在这里，我们报告了Ca²⁺结合的AtMICU的晶体结构，分辨率为2.1 ?。我们的结构显示AtMICU的所有三个EF-hand结构域都能与Ca²⁺结合，并且AtMICU形成了一个具有特定螺旋拓扑结构的独特二聚体界面。值得注意的是，Ca²⁺结合的AtMICU通过其N端螺旋之间的相互作用形成了一个新的四聚体结构。我们的分析进一步表明，Ca²⁺的结合会引起AtMICU的构象变化，这可能有助于其从二聚体状态转变为四聚体状态以实现稳定。这些发现为理解植物中缺乏EMRE时MICU如何调节MCU复合体提供了结构基础，并揭示了MICU蛋白在进化上的保守功能。

引言

线粒体中的Ca²⁺在细胞生物能量代谢、细胞内信号传导和细胞死亡中起着至关重要的作用；因此必须严格控制其水平，以维持线粒体功能并防止Ca²⁺过载[1]、[2]。Ca²⁺进入线粒体基质的主要途径是线粒体钙单向转运蛋白（MCU），这是一种高度选择性的Ca²⁺通道，位于线粒体内膜（IMM）上[3]。在真核生物中，MCU作为一个完整复合体（MCUC）发挥作用，其组成因物种而异，但通常包括形成孔道的MCU和调节性线粒体钙转运蛋白（MICU）[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]。

作为MCU的主要调节蛋白，MICU定位于线粒体膜间隙中，其EF-hand结构域能够检测Ca²⁺浓度[7]。MICU可以形成同聚体或异聚体，在低Ca²⁺浓度下充当“门控蛋白”，并在Ca²⁺结合时促进Ca²⁺的吸收，从而设定单向转运蛋白的激活阈值[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]。在后生动物中，这种调节机制还与EMRE耦合，EMRE对于后生动物的MCU活性是必需的，并通过其多碱性区域与EMRE的酸性C端尾部之间的静电相互作用将MICU1与通道物理连接起来[5]、[18]。尽管在某些壶菌中发现了EMRE的同源物，但在拟南芥和大多数其他陆地植物中尚未找到可识别的EMRE同源物，这表明这些植物系统可能通过不同的分子机制来调节MCU[5]、[19]、[20]。

拟南芥是植物MCU系统的典型代表，它包含MCU和MICU，但不包含EMRE[5]、[20]、[21]。尽管缺乏EMRE，拟南芥仍能进行MCU介导的线粒体Ca²⁺吸收，并且已经证明了MCU与MICU之间的直接相互作用[17]、[22]、[23]、[24]。拟南芥的MICU（AtMICU）可以与Ca²⁺结合并定位在线粒体中，而AtMICU的缺失会导致线粒体基质中的Ca²⁺水平升高，并改变刺激引起的线粒体Ca²⁺瞬变过程的动力学和幅度体内，这支持了AtMICU在植物单向转运蛋白中的“门控”作用[21]。与此一致的是，拟南芥的MCU1（AtMCU1）表现出对钌红敏感的Ca²⁺通道活性，并受到AtMICU的负调控，表明即使在缺乏EMRE的情况下，MCU和MICU之间的核心功能耦合也是保守的[23]。

除了缺乏EMRE之外，植物中的MCU复合体在多个方面也与后生动物中的类型不同。在包括人类在内的脊椎动物中，存在三个MICU同源物（MICU1、MICU2和MICU3），而在植物中根据物种的不同可能存在一个或两个同源物[7]、[8]、[20]、[21]、[25]。拟南芥编码一个MICU同源物，尽管它实际上包含六个MICU同源物，这可能提供了额外的调节灵活性[21]、[23]。此外，植物MICU预计还包含一个额外的第三EF-hand结构域，而哺乳动物的MICU则没有这个结构域[21]、[25]。最近也有报道指出，来自无EMRE谱系的Dictyostelium discoideum的MICU（DdMICU）具有类似的三EF-hand结构[26]。这些特征引发了这样一个问题：植物中的MICU是如何通过不同于典型后生动物MCU-EMRE-MICU系统的分子机制来调节MCU复合体的。

在过去十年中，对人类MICU同聚体和异聚体以及人类MCU-EMRE-MICU复合体的结构研究为理解MCUC的调节机制提供了重要见解[18]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]。尽管大量的功能研究强调了植物MICU和MICU的生理重要性，但对植物MCU系统的实验确定结构信息仍然未知[21]、[23]、[24]、[25]、[35]、[36]、[37]。因此，目前尚不清楚在缺乏EMRE的情况下，植物中的MICU调节机制是如何组织的。在这里，我们利用X射线晶体学、冷冻电镜和生化分析对AtMICU进行了结构分析。我们的数据定义了植物MICU的关键结构特征，并揭示了Ca²⁺依赖性的寡聚态转变。这些数据还为理解在缺乏EMRE的情况下MICU如何调节植物MCU复合体提供了框架。

章节片段

AtMICU的克隆、过表达和纯化

我们使用大肠杆菌（E. coli）的密码子优化了AtMICU（NM_119358.4）构建体，并进行了合成（Macrogen）。本研究中使用的AtMICU构建体如下：AtMICU_Full（残基137–498）、AtMICU_ΔN（残基150–498）、AtMICU_ΔC（残基137–473）和AtMICU_ΔNΔC（残基150–473）。EF-hand突变体构建体是基于AtMICU_Full生成的，具体如下：AtMICU_EFb（D256A/E267K/D450A/E461K）、AtMICU_EF1（D222A/E233K/D450A/E461K）、AtMICU_EF4（D222A/E233K/D256A/E267K）和At

Ca²⁺结合的AtMICU的整体结构

与后生动物形式相比，植物中的MICU预计包含一个额外的EF-hand结构域，并在缺乏EMRE的MCU复合体内发挥作用，尽管这些植物特有特征的结构基础尚未通过实验确定[20]、[21]、[25]。因此，我们确定了Ca²⁺结合的AtMICU的晶体结构，以揭示植物MICU的特性。我们首先结晶了AtMICU_ΔC（残基137–473），其线粒体靶向序列及其N端

讨论

植物采用了一个简化的线粒体钙调节系统，其中不包含EMRE，这就引出了一个基本问题：植物中的MCU是如何 properly 调节MCU复合体的。在这里，我们通过确定Ca²⁺结合的AtMICU结构并描述其Ca²⁺依赖性的构象转变，提供了回答这个问题的结构框架。我们在AtMICU中发现了两个与植物相关的结构特征：PF结构域和额外的EFb结构域，这些结构域似乎起到了作用

结论

本研究通过确定Ca²⁺结合的AtMICU结构并描述其Ca²⁺依赖性的构象转变，为理解植物中的MCU提供了结构框架。我们在AtMICU中发现了两个与植物相关的结构特征：PF结构域和额外的EFb结构域，这些特征在后生动物中不存在。我们还发现，Ca²⁺的结合伴随着FF二聚体拓扑的重排，这种重排允许N端螺旋介导的四聚体化。这些发现共同表明

CRediT作者贡献声明

Jihyeong Yang：可视化、方法学、实验设计、数据分析、撰写——审阅与编辑、初稿撰写。Minwoo Jin：可视化、方法学、数据分析。Jongseo Park：软件开发、方法学、数据分析。Sang A. Mun：方法学、实验设计。Taein Park：方法学、实验设计。Hyunwoo Kim：软件开发、数据分析。Soo Hyun Eom：项目监督、行政管理、方法学、资金获取、概念构思、撰写——审阅与编辑。

资助

本研究得到了韩国政府国家研究基金会（NRF）（项目编号NRF-2021R1A2C1006267）以及由韩国政府资助的Bio&Medical Technology Development Program（项目编号RS-2024-00344154和RS-2024-00440614）的支持。

利益冲突声明

所有作者声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢浦项加速器实验室（PAL；韩国浦项）的BL-5C和11C光束线工作人员在X射线衍射数据收集方面提供的帮助。我们还感谢韩国基础科学研究所（KBSI）和GIST先进仪器分析研究所（GAIA）在冷冻电镜数据采集和处理以及SEC-LS分析方面提供的支持。同时，我们也感谢Sunghyun Hong博士（GreenGene公司）提供的拟南芥叶片。感谢使用冷冻电镜技术

Jihyeong Yang|Minwoo Jin|Jongseo Park|Sang A. Mun|Taein Park|Hyunwoo Kim|Soo Hyun Eom