推进酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）中萜类生物合成：利用合成生物学方法实现高效的长叶烯（longifolene）生产

《Metabolic Engineering》：Advancing terpenoid biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae: Synthetic biology approaches for efficient longifolene production

　　•模块化酵母策略改善了长叶烯的生物合成。•酶的组装和合成酶的筛选提高了途径的产率。•平衡的还原力再生增强了倍半萜的产生。•碳流工程改善了长叶烯前体的供应。•在5升生物反应器中，连续搅拌发酵产生了4.18克/升的长叶烯。

1. 引言
萜类化合物是一类来源于植物、微生物和昆虫的天然产物。它们种类繁多，广泛应用于医药、香料、食品添加剂、农药和生物燃料等领域（Avalos等人，2022年；Yang等人，2022年）。根据碳原子的数量，萜类化合物可以进一步分为半萜（C5）、单萜（C10）、倍半萜（C15）、二萜（C20）和三萜（C30）等（Hu等人，2025年）。随着对萜类化合物研究的深入，越来越多的天然萜类被发现具有独特的生物活性（Li等人，2022年；酵母的基因工程，2021年；单萜和倍半萜的生物合成，2023年）。例如，青蒿素被用作抗疟疾药物，柠檬烯和α-蒎烯是有效的天然杀虫剂，而长叶烯因其高能量密度而被认为是一种潜在的生物燃料（Peralta-Yahya等人，2012年；Manina和Forlani，2023年；Wang等人，2023年；Tisgratog等人，2016年；Marchev等人，2021年；Zhu等人，2022年；Shahidi和Camargo，2016年）。然而，传统的植物提取和化学合成方法面临产量低、成本高和环境污染等问题，这限制了萜类化合物的工业应用（Wang等人，2025年；Sun等人，2026年）。因此，使用微生物，特别是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为萜类化合物生物合成的细胞工厂，已成为一个重要的研究方向（Xin等人，2026年；Wang等人，2024年）。
酿酒酵母因其“一般认为安全”（GRAS）的地位、完善的遗传操作工具、高效的葡萄糖利用能力以及完整的甲瓦龙酸（MVA）途径而受到广泛认可（Liang等人，2021年；Yanagibashi等人，2024年）。MVA途径是真核生物合成异戊二烯前体的核心途径。它以乙酰辅酶A为起始底物，通过一系列反应生成如法尼基焦磷酸（FPP）等中间体，这些中间体进一步用于合成各种萜类化合物（Chen等人，2024年；Liu等人，2022年）。将异源萜类生物合成途径引入酿酒酵母不仅避免了与天然产物提取相关的环境问题，还通过合成生物学技术实现了对产物结构和立体化学的精确控制（Liang等人，2021年；Xing等人，2024年）。目前，酿酒酵母已成功应用于香叶醇和β-石竹烯等萜类化合物的生产（Li等人，2021年；Promdonkoy等人，2022年）。
尽管在酿酒酵母中生产萜类化合物方面取得了显著进展，但高效合成高价值的倍半萜（如长叶烯）仍然面临多个瓶颈（Liu等人，2022年）。长叶烯是一种天然的三环倍半萜，主要存在于松树的重质松节油中。它具有独特的木质香气和多种生物活性，在香料、农药、医药和生物燃料等领域具有巨大潜力（Zhang等人，2024年；Huang等人，2023年）。虽然可以通过植物提取或化学合成获得长叶烯，但这些方法面临生产过程复杂、纯度低和产量有限的挑战（Lusi等人，2022年；Hassan等人，2020年）。
在酿酒酵母中高效生产长叶烯仍受到几个瓶颈的限制。主要限制是异源萜类合成酶的催化效率，因为长叶烯的生物合成需要专门的萜类合成酶。目前从欧洲松（Pinus sylvestris）和台湾黄松中提取的长叶烯合成酶在酿酒酵母中的催化效率相对较高，但在产量方面仍有很大的提升空间（Xin等人，2026年；Hassan等人，2020年）。异源酶的有效表达和功能酶之间的底物通道化是微生物生产外源化合物的常见瓶颈。此外，MVA途径在NADPH辅因子需求和细胞内供应之间存在不平衡：几个关键步骤需要NADPH作为还原剂，但酿酒酵母中的内源性NADPH通常不足以维持高通量的萜类合成（Lu等人，2022年）。另外，细胞质中乙酰辅酶A的通量受限也是一个关键瓶颈。作为MVA途径的起始底物，乙酰辅酶A的可用性直接限制了萜类化合物的产量（Zhang等人，2021年）。在酿酒酵母中，细胞质中的乙酰辅酶A通量通常受到其分流到竞争性代谢途径（包括脂肪酸合成和乙醇发酵）的限制（Jin等人，2023年）。
为了克服这些瓶颈，最近的研究采用了多种策略来提高酿酒酵母中的萜类化合物产量。这些策略包括通过蛋白质工程提高萜类合成酶的催化效率和稳定性，以及筛选具有更高活性的长叶烯合成酶变体（Xia等人，2022年）。此外，优化MVA途径中限速酶的活性也是提高萜类产物产量的另一个关键策略（Lu等人，2022年；Karaca等人，2024年）。辅因子再生工程旨在提高细胞内NADPH的可用性。这可以通过引入或过表达高效产生NADPH的酶（如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶）来实现，从而将更多的碳通量重新导向戊糖磷酸途径（Liang等人，2023年）。碳通量重编程旨在增加细胞质中乙酰辅酶A的可用性，可以通过各种代谢工程策略实现，例如利用丙酮酸脱氢酶（PDH）旁路或引入ATP-柠檬酸裂解酶（ACL）途径来提高细胞质中的乙酰辅酶A水平（Lu等人，2022年）。此外，干扰竞争性代谢途径（如乙醇发酵）可以将更多的碳通量重新导向萜类化合物合成。包括提高细胞质中乙酰辅酶A水平和调节基因拷贝数（ERG1和CrAS）在内的策略已被证明可以显著提高熊果酸和橄榄酸的产量（Jin等人，2023年；Liang等人，2023年）。
最近的研究还展示了组合代谢工程在酿酒酵母中生产萜类化合物的价值，包括柠檬烯、熊果酸/橄榄酸、紫杉二烯、倍半萜生物燃料前体和长叶烯。这些研究表明，途径酶的表达、前体供应、辅因子的可用性和竞争性碳汇都可能限制萜类化合物的生物合成。因此，本研究中使用的各项策略，包括酶的组装、NADPH再生和乙酰辅酶A导向的碳通量工程，不应被视为孤立的概念创新。相反，长叶烯生产的未解决挑战是如何根据长叶烯途径的具体瓶颈选择、排序和定量整合这些工程层。为了说明这一表现，补充表S4比较了不同宿主和菌株、催化酶、工程策略、培养模式、报告的滴度、产量和容积生产率的同行评审的微生物长叶烯生产报告。
尽管已有许多关于酵母萜类化合物生物合成的工程策略，但它们的效果往往取决于具体背景，必须针对特定途径进行平衡。在这项研究中，我们开发了一种以长叶烯为重点的多模块工程策略（图1），该策略整合了催化模块的优化、NADPH再生的平衡以及乙酰辅酶A前体供应的增强。因此，这项工作的主要贡献不是每个单独模块的发明，而是逐步选择和定量整合这些模块以解决酿酒酵母中长叶烯生物合成的具体催化、氧化还原和前体供应瓶颈。具体来说，通过蛋白质工程提高了催化模块的表现，包括RIDD-RIAD酶组装系统和基于结构的psTPS变体评估；通过引入外源甲酸脱氢酶（FDH）和加强内源途径来增强NADPH的可用性；并通过实施非氧化糖酵解（NOG）途径和敲除转录抑制因子DOS2和YNR063W来增加细胞质中乙酰辅酶A的通量。这种系统的多模块整合为酿酒酵母中的可持续长叶烯生产建立了高效平台。由于本工作是在单一目标途径上验证的，我们现在将这种策略描述为一个以长叶烯为重点的模块化工程框架，而不是适用于其他天然产品的通用范式。

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图1. 酿酒酵母中高效生产长叶烯的多模块合成生物学策略。

2. 材料与方法
2.1. 菌株和质粒
本研究中使用的起始菌株为酿酒酵母L17（实验室库存）。经过密码子优化的长叶烯合成酶基因和其他途径基因被克隆到酵母表达质粒或基因组整合盒中，详见补充表S1和S2。补充表S1和S2提供了质粒骨架、相关表达盒、启动子、选择标记、拷贝数状态以及适用时的基因组整合位点。重组质粒通过标准醋酸锂转化方法引入宿主菌株。基因组整合的模块被引入指定的位点，并通过菌落PCR和/或测序进行验证。在含有相应选择标记的固体培养基上选择转化子，以获得重组工程酵母菌株。八个匹配的C × N × P菌株的基因型和因子编码信息提供在补充表S2中。
2.2. 摇瓶发酵
纯化的重组酵母单菌落被接种到含有50毫升选择性培养基的试管中，在30°C下摇晃培养12-16小时。当培养物的光密度（OD600）达到1-2时，通过在4°C下以3000 × g离心3-4分钟收集细胞。弃去上清液后，将细胞沉淀物重新悬浮在无菌双蒸水中（ddH2O），然后转移到含有30毫升培养基的摇瓶中，以达到初始OD600约为0.1。发酵24小时后，按培养体积的15%（v/v）加入正壬烷进行原位产物提取。发酵总共持续120小时，期间定期取样；分离有机相进行产物分析。除非另有说明，摇瓶实验使用了三个独立接种和培养的生物重复实验（n=3）。
2.3. 连续搅拌发酵
纯化的重组酵母单菌落经过两阶段种子培养。首先将细胞接种到含有50毫升选择性培养基的试管中，在30°C下摇晃培养12-16小时（初级种子）。然后将培养物以8%-10%（v/v）的比例转移到含有50毫升培养基的250毫升摇瓶中，继续在30°C下培养24-48小时（次级种子）。从次级种子培养中收集细胞，通过在4°C下以3000 × g离心3-4分钟，然后用100毫升无菌ddH2O洗涤，并接种到含有2升初始培养基的5升生物反应器中，以达到初始OD600约为0.5。发酵参数如下：温度30°C（通过循环冷却水），pH值5.0（通过自动添加KOH溶液），通气速率2 vvm。通过高效液相色谱（HPLC）监测培养液中的葡萄糖和乙醇浓度。当两种底物都低于检测限时开始补充。在发酵72小时时，按培养体积的10%（v/v）加入聚α-烯烃进行原位产物提取。共进行了三次独立的5升连续搅拌发酵。
2.4. 分析方法
2.4.1. 生物量测定
在发酵过程中，每12小时取样一次。适当稀释后，使用紫外-可见光谱仪在600纳米（OD600）处测量光密度以监测细胞生长。
2.4.2. 长叶烯定量
从每个摇瓶生物重复实验或连续搅拌发酵实验中收集上层有机相进行长叶烯分析。样品在12,000 × g下离心1分钟，然后通过GC-MS进行分析（进样温度250°C；载气，高纯度氦气，1毫升/分钟；离子源温度200°C；质量扫描范围m/z 50–300）。通过保留时间与 authentic 标准品匹配（约4.28分钟）和NIST库匹配来鉴定长叶烯。定量使用外部标准校准曲线而不是内部标准方法；在相同的GC-MS条件下分析4、10、25、50和125毫克/升的标准溶液，并将峰面积与长叶烯浓度关联。
在发酵120小时（摇瓶）或连续搅拌发酵结束时（5升生物反应器），取5毫升发酵液样本。通过在4°C下以3000 rpm离心3分钟收集细胞，然后收集上层有机相进行细胞外长叶烯定量。细胞沉淀物用1毫升ddH2O洗涤三次，并使用超声波细胞破碎机（SCIENTZ-IID，宁波新芝）以20%的功率振荡5分钟（开/关周期为3秒）。用1毫升正壬烷三次提取与细胞相关的长叶烯。通过涡旋混合和12,000 rpm离心1分钟合并有机相，收集上层有机相并稀释10倍后进行GC-MS分析。与细胞相关的浓度通过以下公式反算：Ccell = (Cmeasured × dilution factor × total extract volume)/sample volume，并归一化到DCW。总长叶烯浓度是通过将上层有机相中的细胞外浓度与相同体积基础上的细胞相关浓度相加得到的，结果在203小时时为4181.51毫克/升。分析了三个独立的生物学重复实验和三个技术重复实验。

2.4.3. 葡萄糖和乙醇的测定
每个摇瓶生物学重复实验或进料批次运行后的下层水相被分别收集用于底物和副产物分析。样品在12,000 × g的转速下离心1分钟，然后通过高效液相色谱（HPLC）进行检测。HPLC的条件如下：柱温65°C；流动相为5毫摩尔硫酸水溶液，流速为0.6毫升/分钟；进样体积为10微升。通过与标准品的保留时间比较定性鉴定葡萄糖和乙醇，并使用相应的校准曲线进行定量。

2.4.4. 细胞内NADPH/NADP+比例和乙酰辅酶A水平的测定
为了评估辅因子再生和碳流工程的心理效应，测量了代表性逐步工程化菌株的细胞内NADPH/NADP+比例和乙酰辅酶A水平。在指定的发酵时间点收集细胞，迅速淬灭后根据相应的测定方案进行提取。使用商业测定试剂盒测定NADPH和NADP+的含量，并根据测量浓度计算NADPH/NADP+比例。细胞内乙酰辅酶A通过液相色谱-质谱（LC-MS）进行定量，并根据干重（DCW）进行归一化。对于每个菌株在每个指定的采样时间点，分析了三个独立的生物学重复实验（n = 3）。

2.4.5. 角鲨烯和麦角甾醇的定量
在120小时时收集R00、R01和R02的样品，在4°C、3000转/分钟下离心3分钟，用ddH2O洗涤两次，然后使用超声波细胞破裂器（SCIENTZ-IID，宁波新智）破裂细胞，接着在75°C下用0.2%焦性没食子酚和60% KOH（1:1，v/v）进行皂化1.5小时。使用2毫升正己烷提取角鲨烯和麦角甾醇，共进行三个提取循环。使用配备HP-5MS毛细管的Agilent 7890A-5975MS GC-MS进行分析，程序如下：进样温度250°C，载气为氮气，流速1毫升/分钟，离子源温度200°C，全扫描范围50–300道。定量使用角鲨烯和麦角甾醇的标准品，校准范围为4–125毫克/升；未测定回收率。分析了三个独立的生物学重复实验。

2.4.6. 模块贡献和碳平衡相关参数的计算
在相同的摇瓶发酵条件下比较了代表性的逐步工程化菌株。从重复实验测量中计算葡萄糖消耗、乙醇生成、生物量积累、长叶烯浓度、基于葡萄糖的长叶烯产量和平均生产力，然后报告组平均值和标准差。结果中提到的百分比变化是根据相应的组平均值计算得出的。碳平衡相关部分是根据每个菌株的葡萄糖消耗、长叶烯、乙醇和生物量平均值计算得出的，剩余部分报告为其他或未计入的碳。因此，堆叠的条形图提供了描述性的碳平衡相关评估，并不代表同位素辅助的代谢通量分析。

2.5. 野生型和S433A psTPS的分子动力学模拟和结构分析
进行了分子建模和分子动力学（MD）模拟，以探索S433A替代在psTPS中的可能结构后果。这些模拟用于生成结构假设，并未用于估计Km、kcat、kcat/Km、结合亲和力或反应自由能障碍。首先使用Proteinx（20250630_v1.0.0）生成psTPS-FPP复合物模型。根据烟草属（Nicotiana tabacum）的倍半萜环化酶（PDB ID: 5EAT）的晶体结构对初始复合物模型进行了优化，该酶的活性口袋中含有FPP类似物。根据参考结构指定了活性中心中的Mg2+离子的数量和位置。在pH 7.2下调整了蛋白质-配体系统的质子化状态。蛋白质使用AMBER99SB-ILDN力场描述，MD模拟使用GROMACS 2024进行。每个系统在NVT集合下平衡100皮秒，然后在NPT集合下再次平衡100皮秒。为野生型psTPS和S433A生成了五个50纳秒的生产轨迹（每个构建物总共250纳秒）。作为描述性比较，处理轨迹级别的值而不是汇总的模拟帧。定义了初级近攻构象（primary NACs），即FPP的C15和C2之间的距离<4.5埃，C2-C15-O1的攻击角度>130°，并且C15-C2的距离至少比C15-C4的距离短0.2埃。closed/NAC兼容构象被定义为同时满足初级NAC标准和轨迹分析中使用的预定义的封闭状口袋标准的帧。在这个构象子集中计算了核心水占据率，即包含至少一个水分子在预定义的C15/C14/C12反应核心区域的帧的比例。所有指标都是分别为每个生产轨迹计算的。由于经典MD不模拟键的形成或断裂，这些基于几何的分类仅用于比较采样的构象集合，并不解释为底物亲和力、Km、kcat、kcat/Km、催化转化率或反应自由能障碍的直接测量。

2.6. 统计分析
除非另有说明，定量摇瓶发酵和生理测量使用了三个独立的生物学重复实验（n = 3），定义为独立接种和发酵的培养物。数据以平均值±标准差（SD）呈现，除非另有说明，否则误差条或阴影带表示SD。菌株间的定量终点比较使用单向方差分析（ANOVA）进行，然后使用Tukey的多重比较检验，在每个ANOVA家族内的菌株比较中应用Tukey调整。对于指定的采样时间的测量，只有在明确报告了该时间点的推断比较时，才使用单独的一向ANOVA和Tukey检验。完整的生长曲线和发酵时间过程轮廓是描述性评估的；没有进行整体时间效应或菌株-时间交互作用的推断检验。统计显著性定义为Tukey调整后的P < 0.05；其中显示的，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；ns，调整后的P ≥ 0.05。每个构建物生成了五个独立的50纳秒分子动力学轨迹（n = 5个轨迹），轨迹内的帧不被视为独立观察。进行了三个独立的5升进料批次发酵。

2.7. 匹配因子设计和分析
为了量化三个工程模块的单独和共同贡献，使用在相同R36衍生背景下生成的八个匹配菌株进行了平衡的2 × 2 × 2因子实验，这些菌株在表达负担和基因组整合位点配置上相匹配，FDH5、DOS2Δ和YNR063WΔ保持不变。C代表ERG20和psTPS(S433A的RIDD–RIAD组织，N代表ZWF1 + SOL3，P代表Lm-PK + Bs-PTA。所有八种组合在相同的摇瓶条件下使用三个独立的生物学重复实验（n = 3）进行评估。长叶烯浓度是主要终点；120小时时的OD600和基于葡萄糖的长叶烯产量（毫克长叶烯/克消耗的葡萄糖）是次要终点。因子数据使用全线性模型Y ～ C*N*P进行分析，包括三个主要效应、所有三个两因子交互作用和三个因子交互作用。主要效应作为相应边际平均值之间的差异进行估计，效应估计值附带95%的置信区间。在每个终点内，P值使用Holm程序在七个因子项之间进行调整，部分η2作为效应大小度量。Holm调整后的P < 0.05被认为具有统计显著性。

3. 结果和讨论
3.1. 酶组装和结构指导的psTPS优化
长叶烯是一种由松树物种产生的微量倍半萜类次级代谢物，其专用萜类合酶的催化活性天然较低，这对异源生产构成了主要瓶颈。在这里，我们使用RIDD-RIAD酶组装系统将法尼基二磷酸合酶基因ERG20与长叶烯合酶基因psTPS融合，构建了一个底物通道代谢支架。这种方法在测试条件下增加了整个细胞的长叶烯产量。由于没有直接测量FPP转移、局部FPP浓度、非酶促损失和内在的psTPS动力学，因此结果无法确定底物通道或增强的内在催化效率。此外，还对psTPS进行了靶向突变，以识别具有改善体内途径性能的变体，并通过分子动力学分析了表现最佳变体的结构基础（图2和补充图5和6）。

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图2. 酶组装和在酿酒酵母中的理性设计。

3.1.1. ERG20和psTPS的组装
为了优化ERG20和psTPS之间的协调催化，我们实施了两种不同的蛋白质支架系统：SpyTag/SpyCatcher和RIDD/RIAD。与传统的直接融合或柔性连接器肽不同，这些支架依赖于高度特异性的分子识别和结合，以精确控制酶的化学计量和空间接近性，从而改变酶的接近性和化学计量，这可能影响整个细胞的途径性能（Pihl等人，2023年；Wang和Sun，2021年）。
发酵结果显示，引入任一蛋白质支架系统对宿主细胞生长没有显著影响（图3a）。然而，它们对长叶烯生物合成的影响却有明显不同。表达SpyTag/SpyCatcher支架的菌株（R01）表现出的长叶烯浓度低于对照组，这可能是由于SpyCatcher域较大（113个氨基酸）以及它通过延长的柔性连接器与目标酶的连接，导致活性位点的空间分离过度，阻碍了功能性酶簇的形成，可能干扰了天然酶的构象或亚细胞定位。相比之下，包含RIDD/RIAD支架的菌株（R02）实现了长叶烯产量显著增加了36%（图3b）。这一结果与预期一致：在RIDD/RIAD系统中，RIAD标记的ERG20与RIDD标记的psTPS以2:1的化学计量组装在一起。鉴于psTPS通常被认为是这个双酶系统中的限速步骤，RIDD/RIAD配置与更高的长叶烯浓度和较低的终点角鲨烯和麦角甾醇池相关。这些终点数据与FPP衍生物代谢物的重新分配一致，但并没有直接证明FPP通道、ERG20到psTPS的转移或途径流量的增加。

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图3. 在酿酒酵母中使用不同蛋白质支架系统增强长叶烯生物合成。(a.) 使用不同蛋白质支架的工程菌株的生长曲线（生物量作为OD600随时间的变化）（R00：无支架，R01：SpyTag/SpyCatcher和R02：RIDD/RIAD）。线条显示平均值，阴影带显示标准差。(b.) 不同支架策略的菌株在摇瓶中的长叶烯浓度比较，表明优化支架的性能更优。数据以三个独立生物学重复实验的平均值±标准差（n = 3）呈现。统计显著性通过单向ANOVA后跟Tukey的多重比较检验确定。不同的字母或星号表示显著差异（*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；ns，不显著）。120小时时的终点测量显示R02的长叶烯浓度高于R00（74.95 ± 2.75对比55.10 ± 2.30毫克/升），终点角鲨烯（1.46 ± 0.12对比1.82 ± 0.14毫克/克干重）和麦角甾醇池（8.19 ± 0.38对比8.72 ± 0.41毫克/克干重）也更低（补充图S11）。这些终点池与FPP衍生物代谢物的重新分配一致。

3.1.2. 结构指导的psTPS变体评估
为了识别具有改善体内途径性能的psTPS变体，我们使用深度学习框架EITLEM-Kinetics来优先选择候选突变进行实验评估。所有突变质粒都经过序列验证并转化到生产菌株中进行发酵验证。在测试的变体中，S433A显示出最高的平均终点长叶烯浓度，比野生型psTPS对照高出约22%（图4b）。由于在测试条件下无法充分重复地进行psTPS和S433A的直接体外动力学测量，我们基于发酵性能和结构分析来解释S433A的效果，而不是报告不可靠的Km或kcat值（Shen等人，2024年）。

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图4. psTPS的理性突变增强了长叶烯的生产。(a.) 表达不同突变体的工程菌株的生长曲线（生物量作为OD600随时间的变化）。线条显示平均值，阴影带显示标准差。(b.) 不同突变体的发酵验证。数据以三个独立生物学重复实验的平均值±标准差（n = 3）呈现。统计显著性通过单向ANOVA后跟Tukey的多重比较检验确定。不同的字母或星号表示显著差异（*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；ns，不显著）。结构建模和分子动力学分析显示，残基433位于靠近底物结合口袋的环区域内。S433A突变不仅仅稳定了整个活性口袋；相反，它改变了局部近底物口袋的集合。与野生型psTPS相比，S433A增加了封闭/产物构象的比例，并减少了C15/C14/C12反应核心区域的水占据率（补充图5）。结构比较进一步表明了底物结合口袋周围的局部重组（补充图6）。这些结果表明S433A可能有利于更催化兼容的局部微环境，尽管在测试的体外测定条件下无法可靠地确定直接的动力学参数。

3.2.**辅因子再生优化**

NADPH在萜类化合物的生物合成中扮演着核心的还原剂角色，驱动着多个关键反应。首先，在MVA途径中，NADPH为HMG-CoA还原酶催化的HMG-CoA转化为甲羟戊酸（mevalonate）提供必要的还原当量，而甲羟戊酸是异戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）的直接前体，这两种物质是所有萜类化合物的基本构建块。其次，NADPH还参与了HMG-CoA还原酶催化的HMG-CoA转化为甲羟戊酸的过程，从而支持IPP和DMAPP的供应，最终为长叶烯（longifolene）的生物合成提供原料。

为了缓解细胞内NADPH的不足，我们向酿酒酵母（S. cerevisiae）的基因组中引入了外源性的FDH基因，以提供稳定的还原力来源。在此基础上，我们过度表达了八种内源性NADPH再生酶：琥珀酸半醛脱氢酶（UGA2）、苹果酸酶（MAE1）、胞质异柠檬酸脱氢酶（IDP2）、NADH激酶（POS5）、6-磷酸葡萄糖脱氢酶（GND1和GND2）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（ZWF1）以及6-磷酸葡萄糖内酯酶（SOL3），以全面提升细胞内辅因子的再生效率。

FDH能够催化甲酸氧化生成二氧化碳（CO2）的同时再生NADPH，成为增强细胞内还原力的有效手段。摇瓶发酵实验表明，将FDH基因整合到酵母基因组显著促进了工程菌株的生长（图5a）。这一观察结果不仅证实了FDH在支持萜类化合物合成中的有效性，还揭示了其表达水平与宿主生理状态之间的密切关联。值得注意的是，这些实验中并未添加外源性甲酸底物。先前的研究表明，酵母在葡萄糖代谢过程中会生成少量的内源性甲酸，这部分内源性甲酸可能有助于FDH依赖的NADPH再生，尽管其作用程度尚未被量化。避免添加外源性甲酸还可以降低工艺复杂性和潜在的甲酸相关压力。

**图5. 外源性FDH的整合增强了长叶烯的生物合成。**(a) 工程菌株在不包含FDH基因组整合和包含FDH基因组整合时的生长曲线（生物量以OD600表示）。**(b) 包含FDH基因组和不含FDH基因组的菌株中的长叶烯产量比较。数据表示为三次独立生物学重复实验的平均值±标准差（n = 3）。统计显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Tukey多重比较测试确定。不同字母或星号表示差异显著（*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001；ns，无显著差异）。

对于酿酒酵母中的八种内源性NADPH再生酶，单独过表达每种酶对细胞生长没有显著抑制作用（图6a）。然而，它们对长叶烯产量的影响各不相同：UGA2、MAE1、IDP2和POS5的过表达导致产量下降，可能是由于中央碳代谢流的扰动；相比之下，戊糖磷酸途径相关酶GND1、ZWF1和SOL3的过表达在不同程度上提高了产量，其中SOL3的过表达效果最为显著（图6b）。

**图6. 内源性NADPH再生酶的过表达对长叶烯产量的差异性影响。**(a) 过表达不同内源性NADPH再生酶的工程菌株的生长曲线（OD600随时间变化）。**(b) 与对照组相比，过表达每种酶的菌株中的长叶烯产量。数据表示为三次独立生物学重复实验的平均值±标准差（n = 3）。统计显著性通过单因素方差分析后进行Tukey多重比较测试确定。不同字母或星号表示差异显著（*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001；ns，无显著差异）。

基于上述筛选结果，我们对三种最有效的PPP相关基因GND1、ZWF1和SOL3进行了组合过表达。发酵结果显示，双基因组合进一步增加了长叶烯的产量，而三基因共表达菌株的产量则低于最佳的双基因组合（图7b）。这一结果表明，NADPH的再生仅在适当的代谢范围内才能促进长叶烯的生物合成，过度增强PPP可能会带来碳分配的权衡。

**图7. 在外源FDH整合的基础上，组合增强有益的内源性NADPH再生酶进一步提升了长叶烯的生物合成。**(a) 工程菌株的生长曲线（OD600随时间变化）。**(b) 长叶烯产量。(c) 关键发酵时间点的细胞内NADPH/NADP+比率。(d) 工程菌株中的基因表达水平（深色填充表示相应基因的过表达）。数据表示为三次独立生物学重复实验的平均值±标准差（n = 3）。统计显著性通过单因素方差分析后进行Tukey多重比较测试确定。不同字母或星号表示差异显著（*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001；ns，无显著差异）。

为了直接评估这种权衡，我们在选定的发酵时间点测量了细胞内的NADPH/NADP+比率。如图7c所示，过表达NADPH再生基因的菌株显示NADPH/NADP+比率高于对照组，证实了PPP工程增强了细胞内还原力的可用性。然而，尽管氧化还原状态得到改善，三基因共表达菌株的长叶烯产量并未成比例增加。这种差异表明，过多的碳分配给PPP介导的NADPH生成可能会限制用于乙酰-CoA形成和下游MVA途径流动的糖酵解碳。因此，最佳的辅因子再生策略不是最大化PPP的激活，而是平衡PPP的增强效果。

**3.3. 碳流优化**

**3.3.1. 引入非氧化性糖酵解途径以补充胞质乙酰-CoA**

为了增强MVA途径的前体供应，我们将NOG途径引入了酿酒酵母。NOG途径将戊糖磷酸途径的中间体（如果糖-6-磷酸和/或木酮糖-5-磷酸）转化为乙酰磷酸，后者随后被转化为乙酰-CoA（图8）。其主要优势在于最小化以二氧化碳形式损失的碳，从而提高碳转化为乙酰-CoA的效率，并增加胞质中乙酰-CoA的可用性。

**图8. NOG途径的示意图。**

NOG途径的功能实现依赖于两种关键酶：磷酸酮醇酶（PK）和磷酸转乙酰酶（PTA）。我们比较了来自不同来源的五种PK同源物——Ba-PK（Bifidobacterium adolescentis）、Bb-PK（Bifidobacterium breve）、Bd-PK（Bifidobacterium dentium）、Ca-PK（Clostridium acetobutylicum）和LM-PK（Leuconostoc mesenteroides），以及两种PTA同源物——Bs-PTA（Bacillus subtilis）和Ts-PTA（Thermoanaerobacterium saccharolyticum）。构建了多种PK-PTA组合，并系统评估了它们提升胞质乙酰-CoA流量的能力（图9）。

**图9. 来自不同来源的PK或PTA同源物单基因表达对长叶烯产量的影响。**(a) 表达不同PK变体的菌株的生长曲线（OD600随时间变化）。**(b) 表达不同PK变体的菌株中的长叶烯产量。(c) 表达不同PTA变体的菌株的生长曲线（OD600随时间变化)。**(d) 表达不同PTA变体的菌株中的长叶烯产量。数据表示为三次独立生物学重复实验的平均值±标准差（n = 3）。统计显著性通过单因素方差分析后进行Tukey多重比较测试确定。不同字母或星号表示差异显著（*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001；ns，无显著差异）。

仅表达PK的菌株表现出明显的生长缺陷和长叶烯产量下降，这可能是由于缺乏高效下游转化导致有毒中间体乙酰磷酸的积累。尽管总体生长受到抑制，但表达Bd-PK、Ca-PK或LM-PK的菌株产生的长叶烯产量显著高于表达Ba-PK或Bb-PK的菌株，表明前三种酶的酶学性能更优。因此，选择了Bd-PK、Ca-PK和LM-PK进行后续的组合测试。相比之下，单独过表达PTA对细胞生长没有明显不良影响。值得注意的是，单独表达Bs-PTA使长叶烯产量相比对照组增加了约12%，这表明内源性产生的乙酰磷酸足以被Bs-PTA利用来产生额外的乙酰-CoA，从而部分补充了MVA途径的流量并促进了萜类化合物的合成。因此，选择Bs-PTA进行进一步的组合分析。

**图10. 来自不同来源的PK和PTA同源物的组合表达增强了长叶烯的产量。**(a) 共表达不同PK-PTA组合的菌株的生长曲线（OD600随时间变化）。**(b) 共表达不同PK-PTA组合的菌株中的长叶烯产量。(c) 工程菌株中的基因表达水平（深色填充表示相应基因的过表达）。数据表示为三次独立生物学重复实验的平均值±标准差（n = 3）。统计显著性通过单因素方差分析后进行Tukey多重比较测试确定。不同字母或星号表示差异显著（*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001；ns，无显著差异）。

**3.3.2. 去除负调控因子进一步增加产量**

为了缓解MVA途径的转录抑制，我们针对三个已知的负调控因子（DOS2、YNR063W和YER134C）进行了敲除。使用CRISPR-Cas9技术生成了单基因敲除和双基因敲除菌株，并通过菌落PCR和Sanger测序进行了验证。

发酵分析显示，敲除这些因子后菌株表现出不同的表型（图11）。YER134C的敲除对细胞生长和长叶烯产量均有负面影响。相比之下，单独敲除DOS2或YNR063W增加了产量。更重要的是，双基因敲除菌株（DOS2和YNR063W）表现出显著的叠加效应，其产量显著超过对照组。这些结果证实，在这种工程背景下，DOS2和YNR063W对萜类化合物的生物合成具有抑制作用，而YER134C的功能可能是条件性的或依赖于具体环境的。

**3.4. 多模块合成生物学策略的整合**

在对单个合成瓶颈进行系统评估的基础上，我们在最终的构建过程中整合了催化工程、辅因子再生平衡、调控因子删除和前体供应工程。由于这些菌株包含了依次累积的改变，而不是多种模块组合的乘积效应，因此比较结果反映了特定构建过程中的表型特征，而不是单一模块间的相互作用。

代表性菌株的摇瓶发酵显示，在最终构建过程中逐步改善了性能（图12）。与R10相比，结合调控因子删除和催化工程的R37产量提高了69.51 mg/L。随后引入平衡的NADPH再生模块后，产量进一步提高到81.01 mg/L。加入Lm-PK + Bs-PTA前体供应模块后，产量达到了92.84 mg/L。由于R37同时包含了调控因子删除和催化修饰，因此R10与R37的比较并不能单独评估C模块的效果。同样，连续的菌株变化支持了添加的工程层与表型之间的关联，而不仅仅是模块间相互作用的简单展示。

**图12. 最终整合菌株的摇瓶发酵性能。(a) 多模块整合菌株的生长曲线（OD600随时间变化）。**(b) 多模块整合菌株中的长叶烯产量。数据表示为三次独立生物学重复实验的平均值±标准差（n = 3）。统计显著性通过单因素方差分析后进行Tukey多重比较测试确定。不同字母或星号表示差异显著（*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001；ns，无显著差异）。

生理测量结果显示，在辅因子再生工程后，细胞内的NADPH/NADP+比率有所提高；而在碳流重新编程后，细胞内的乙酰-CoA水平和碳分布发生了变化（补充图S1–4）。终点乙酰-CoA和NOG相关代谢物池以及细胞外副产物的数据分别见补充图S12和S13；这些描述性测量结果本身并不能确定模块间的通量或因果关系。

**3.4.2. 去除负调控因子进一步增加产量**

为了缓解MVA途径的转录抑制，我们针对三个已知的负调控因子（DOS2、YNR063W和YER134C）进行了敲除。CRISPR-Cas9技术用于生成单基因和双基因敲除菌株，并通过菌落PCR和Sanger测序进行了验证。

发酵分析显示，敲除这些因子后菌株表现出不同的表型（图11）。YER134C的敲除对细胞生长和长叶烯产量均有负面影响。相比之下，单独敲除DOS2或YNR063W增加了产量。更重要的是，双基因敲除菌株（DOS2和YNR063W）表现出显著的叠加效应，其产量明显优于对照组。这些结果证实，在这种工程背景下，DOS2和YNR063W对萜类化合物的生物合成具有抑制作用，而YER134C的功能可能是情境依赖性的或条件性的。

**3.4. 多模块合成生物学策略的整合**

在系统评估了各个合成瓶颈后，我们在最终构建过程中整合了催化工程、辅因子再生平衡、调控因子删除和前体供应工程。由于这些菌株包含了连续累积的修改，而非多种模块组合的乘积效应，因此比较结果反映了特定构建过程中的表型特征，而不是单个模块间的相互作用。

代表性菌株的摇瓶发酵显示，在最终构建过程中性能逐步提高（图12）。与R10相比，结合调控因子删除和催化工程的R37产生了69.51 mg/L的长叶烯。随后引入平衡的NADPH再生模块后，产量进一步提高到81.01 mg/L。加入Lm-PK + Bs-PTA前体供应模块后，产量达到了92.84 mg/L。由于R37同时包含了调控因子删除和催化修饰，因此R10与R37的比较并不能单独评估C模块的效果。同样，连续的菌株变化也支持了添加的工程层与表型之间的关联，而不仅仅是模块间相互作用的简单证明。

这些终点测量和描述性的碳分布数据本身并不能确定模块间的通量或因果关系。为了区分模块效应与历史构建顺序的影响，我们分析了一个2×2×2×C×N×P的矩阵（补充图S9和S10；补充表S2）。完整模型解释了长叶烯产量变化的97.1%（F(7, 16) = 77.51, P = 3.77×10?11）。在其他两个因素C、N和P的影响下，产量分别增加了7.94、10.38和10.86 mg/L（Holm校正后的P值分别为4.63×10?8、1.13×10?9和6.74×10?10；部分η2值分别为0.879、0.926和0.932），而在校正后，没有任何两个或三个因素的交互作用仍然显著（所有Holm校正后的P值均≥0.131）。在基于葡萄糖的长叶烯产量（每克消耗的葡萄糖产生的长叶烯毫克数）方面也观察到了相同的定性模式，其中三个主要效应均显著，且在Holm校正后所有交互项均不显著。对于120小时时的OD600值，校正后没有任何单个因子项保持显著。这些结果支持在测试条件下这三个模块具有积极且主要是叠加性的贡献，而不是统计学上的协同作用。为了实现使用高产菌株R39的可扩展生产，我们在一个工作体积为2升的5升生物反应器中实施了一种“脉冲式” Fed-batch 发酵策略（图13）。在初始葡萄糖消耗完后，间歇性地加入高浓度葡萄糖（20-40克/升），以提供短暂的碳源，促进细胞快速生长和产物合成。该菌株在204小时时达到了OD600=109.1的峰值生物量，胞外长叶烯浓度达到3484.79毫克/升，细胞相关长叶烯浓度为696.72毫克/升，总浓度达到4181.51毫克/升。根据这种发酵曲线，平均生产力为0.0205克/升/小时。到最大生产时间点为止，总葡萄糖消耗量为2675克，相应的基于葡萄糖的长叶烯产量为0.00313克/克葡萄糖。作为参考，之前报道的最大反应器中的长叶烯浓度是在240小时时为2063.7毫克/升（Xin等人；补充表S4）。尽管不同研究中的反应器配置、产物回收率、发酵时间及细胞相关产物的包含情况有所不同，但R39仍实现了最高的总浓度。