《Digital Chemical Engineering》：Ensemble Physics-Informed Neural Networks for Dynamic Modelling of PHA production by
Cupriavidus necator Using Black Soldier Fly Larvae Feedstock
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聚羟基脂肪酸酯（PHA）是多种微生物用作胞内碳源和能源储备的线性聚酯。由于PHA具有固有的生物相容性、在有利环境条件下的生物可降解性以及可调控的热塑性，自早期细菌PHA研究以来，这类聚酯一直被定位为石油基塑料的可持续替代品。其中，聚(3-羟基丁酸酯)（P3HB
聚羟基脂肪酸酯（PHA）是多种微生物用作胞内碳源和能源储备的线性聚酯。由于PHA具有固有的生物相容性、在有利环境条件下的生物可降解性以及可调控的热塑性，自早期细菌PHA研究以来，这类聚酯一直被定位为石油基塑料的可持续替代品。其中，聚(3-羟基丁酸酯)（P3HB）及其共聚物聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)（P3HB-co-3HV）尤其重要，因为其热力学和力学性能可通过胞内单体组成进行调节。然而，尽管经过数十年的代谢和工艺开发，与合成聚合物相比，工业PHA生产仍因生产成本高而受限。Cupriavidus necator是研究最广泛的PHA生产菌种之一，因其胞内聚合物积累量可达细胞干质量的约90%，且代谢途径表征较为清楚。在C. necator中，聚合物积累受碳可利用性与必需营养物（尤其是氮）限制之间失衡的调控。在碳过量与氮限制条件下，代谢通量从活性生物质形成转向胞内聚合物储存。然而，促进PHA积累的同一限制也可能限制细胞生长，降低总体积产率。因此，初始碳源浓度（C）和碳氮比（C/N）等设计参数是优化PHA体积产率、得率和PHA单体组成的关键因素。使用复杂底物基质（如本研究采用的黑水虻幼虫（BSFL）衍生油脂）进一步增加了工艺开发的复杂性。植物油和动物脂肪残留物是有吸引力的底物，因其高能量密度可支持高聚合物得率并改善PHA生产过程的循环性。在此背景下，BSFL生物转化也具有相关性，因为它可将有机残留物转化为富含脂质的二次原料，而不直接与粮食作物应用竞争。然而，BSFL衍生油脂也带来额外的工艺开发挑战，因为碳源是复杂且可变的脂肪酸混合物，而非单一确定底物。此外，过程分析的复杂性和成本进一步制约了工艺开发，后者往往依赖于少量稀疏采样的培养实验。过程模型是支持工艺开发的重要工具，可在最小化大量实验需求的同时优化产率和得率。实验数据稀缺是早期工艺开发的典型特征，原则上有利于机理建模框架。纯数据驱动模型（如人工神经网络（ANNs））可有效逼近非线性关系，但通常需要大量数据才能可靠训练和预测。在稀疏数据集上训练时，这类模型容易过拟合，并可能产生违反基本物理原理的预测。相比之下，经典机理模型保持了物理可解释性，但在有限实验数据校准下可能过度参数化且可辨识性差。混合模型通过在统一工作流中整合经验框架和机理框架提供了中间途径。对于PHA案例，混合控制论建模已应用于以果糖和乙酸为进料的C. necator过程，而第一性原理/机器学习混合建模已被用于描述其他微生物系统中的连续PHA生产。动态模型选择研究也强调，PHA动力学结构不应仅通过启发式拟合选择，而应使用验证性能、置信区间、敏感性分析和信息准则进行评估。物理信息神经网络（PINNs）已成为一种有前景的混合建模技术。PINNs将机理微分方程的残差直接纳入训练目标函数，使神经网络能够同时从实验过程数据和主导机理方程中学习。PINNs对于以稀疏数据集为特征的生物过程开发尤其有吸引力，因为网络不仅被训练以复现有限实验观测，还需在未测量配点上满足物料平衡约束。然而，纳入物理残差并不固有保证可靠收敛或稳健泛化。近期研究表明，PINNs可能遭受损失项失衡、梯度病态和非线性或刚性系统中的优化失败，尤其是当实验数据和物理残差处于不同数值尺度时。这些问题在生物系统中尤为相关，因为测量稀疏、噪声大、尺度不均且数量有限。集成建模为提高数据驱动系统的泛化性能和估计认知不确定性提供了实用策略，此前已应用于使用有限实验数据集校准的生物过程混合模型。然而，PINNs中的集成建模和认知不确定性估计在文献中仍 largely 未被探索。因此，核心挑战不仅在于施加物理约束，而在于部署一个集成建模工作流，在统一框架内处理过程数据、先验机理知识、训练与验证策略以及不确定性量化。在本研究中，研究人员使用PINN集成框架应对这些挑战。该框架以利用复杂BSFL衍生脂质底物的C. necator PHA生产过程进行展示。在研究人员此前理论研究的基础上，开发了用于C. necator PHA生产过程的双ANN PINN模型，明确将状态参数化与动力学速率参数化解耦。状态网络（FFNN-S）用于表示连续时间依赖的状态轨迹，而速率网络（FFNN-R）建模物料平衡方程中出现的动力学项。这种分离保留了过程的宏观平衡结构，而无需施加预定义的经验动力学定律。为实现严格的超参数优化和模型选择，将留一批次交叉验证（LOBO-CV）与基于Optuna的优化相结合。评估了四种不同的目标函数，以研究数据损失、物理损失、数据-物理组合损失和简约正则化如何在稀疏数据条件下影响模型选择。随后将五折模型聚合为集成，从而减少对单一确定性PINN实现的依赖。总体而言，所提出的框架建立了一种物理信息、验证驱动且不确定性感知的动态生物过程建模方法，适用于实验数据稀缺条件。
研究背景方面，聚羟基脂肪酸酯（PHA）作为微生物胞内碳氮能源储备的线性聚酯，因其生物相容性、生物可降解性和可调控热塑性被视为石油基塑料的可持续替代品，其中聚(3-羟基丁酸酯)（P3HB）及其共聚物聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)（P3HB-co-3HV）尤为重要。Cupriavidus necator是研究最广泛的PHA生产菌种之一，胞内聚合物积累可达细胞干质量约90%，其聚合物积累受碳可利用性与氮限制之间失衡调控。然而工业PHA生产因成本高于合成聚合物而受限。使用黑水虻幼虫（BSFL）衍生油脂等复杂底物基质虽具高能量密度和循环性优势，但碳源为复杂可变的脂肪酸混合物，加之过程分析复杂昂贵，导致培养实验稀疏采样。过程模型是支持工艺开发的重要工具，但纯数据驱动人工神经网络（ANNs）在稀疏数据下易过拟合且可能违反物理原理，经典机理模型在有限数据下易过度参数化且可辨识性差。物理信息神经网络（PINNs）将机理微分方程残差纳入训练目标，但存在损失项失衡、梯度病态和优化失败等问题，且PINNs中的集成建模与认知不确定性估计尚待探索。因此研究人员开展本研究，旨在建立物理信息、验证驱动且不确定性感知的动态生物过程建模框架。研究结论表明，双ANN PINN集成框架在数据有限条件下准确复现了主要过程动态并保持与物料平衡的一致性；集成前五折模型平均留出验证R2为0.60，集成后总体R2达0.87，物理残差误差从0.0649降至0.0095；集成聚合在保持物理信息结构的同时降低了折间变异性，并提供量化认知不确定性的预测置信区间，可识别过程域中额外实验最具信息量的区域；该框架具有通用性，可适配其他生物过程开发场景。其重要意义在于为数据稀缺条件下的动态生物过程建模和认知不确定性估计提供了物理信息神经网络集成框架，所建立的因果关系的模型可用于优化初始碳氮浓度以实现高体积PHA产率和/或所需PHA组成，95%预测置信区间可区分风险与安全的控制设计。
关键技术方法方面，研究人员采用3 L生物反应器（2 L工作体积）以批式模式开展五组C. necator培养，初始硫酸铵0.9–2.7 g/L、BSFL油脂40–120 g/L为唯一碳源，10%（v/v）接种，30°C、pH 7.00、溶解氧20%空气饱和度；构建双ANN PINN结构，FFNN-S参数化状态变量、FFNN-R参数化动力学速率，通过自动微分（AD）计算导数并定义物理残差；采用复合损失函数（数据损失、初始条件损失、物理损失），以AdamW优化器训练并含权重dropout；采用LOBO-CV结合Optuna进行超参数优化和模型选择，评估四种选择准则；以均匀平均聚合五折模型构建集成，并按Student t分布估计95%置信区间。
研究结果方面，生物反应器培养与过程动态：五组批式培养显示活性生物质合成、脂质多底物消耗、氮耗尽与胞内聚合物积累强耦合，M3（80 g/L油、1.8 g/L铵）端点细胞干质量最高（37.46 g/L，60 h）、PHA体积产率最高（0.40 g/L/h）、PHA得率最高（0.65 g/g），M2最低，表明单独增加底物或氮可利用性并不单调改善PHA形成。数据分析：Pearson相关热图显示实测脂肪酸种类与总残留底物S几乎完全相关，故采用总残留底物S表示脂质碳源以降维。模型选择与超参数优化：四种选择准则中，基于平均训练与平均验证数据损失组合（目标1）获得最高验证R2（0.604±0.0730），选定FFNN-S为4×6×6×6×5、FFNN-R为5×7×7×5、tanh激活；折模型1、2、3验证数据损失最低，折4、5较高，反映高碳边缘条件更难预测。数据-物理权重系数（λ）影响：λ=0.5时平均留出验证数据损失最低（0.2314±0.0803），排除物理损失（λ=0）验证数据损失较高（0.3382±0.1580），λ增至0.90物理损失降低但验证数据损失升高。PINN集成性能与物理一致性：集成后数据 parity 更集中于对角线，集成R2为X 0.91、S 0.94、N 0.88、3HB 0.75、3HV 0.83，五模型集成使数据损失从0.302降至0.0123、R2从0.82升至0.87，物理损失从0.0649降至0.0095。动态模拟与认知不确定性：五折PINN集成复现了生物质增长、底物消耗、铵耗尽及氮耗尽后3HB和3HV延迟积累，高碳条件下底物和聚合物积累后期不确定性带较宽，对预测浓度施加零下界硬约束以避免负值。
讨论部分总结：开发早期工艺动态模型具有挑战性，因生物学理解不足且数据常不足以可靠建模；BSFL衍生脂质底物复杂组成及低通量昂贵分析限制动力学数据量；既往动力学模型在复杂脂质混合物下适用性不确定。本研究提出双ANN PINN集成框架及认知不确定性估计以应对数据稀缺，集成策略在机器学习和混合建模中已用于提高预测稳健性，但集成PINN在生物过程建模中尚待探索；贝叶斯PINN框架提供更正式的不确定性传播途径但计算需求高。LOBO-CV在平衡描述与预测性能中起核心作用，每折验证代表完整未見培养，常规逐点五折交叉验证因同批测量时间相关导致数据泄漏、预测误差过于乐观和置信区间过窄。模型选择方面，PINNs因多损失项需平衡优化而更具挑战，基于组合平均训练与验证数据损失的准则预测力最高，仅基于物理残差的准则未转化为更好预测，AICc偏好较小模型但损失最高。关键结果是集成平均同时改善预测性能和物理一致性，数据损失锚定模型于实测培养行为、物理损失约束学习轨迹与物料平衡一致，二者互补。所开发PINN集成建立了控制自由度（初始C和N浓度）与关键状态变量动态之间的因果关系，可用于优化初始C和N浓度以实现高体积PHA产率和/或所需PHA组成，95%预测置信区间可区分风险与安全控制设计，但置信区间后期较宽表明在应用于实际过程控制前需更多数据。研究结论翻译：本研究开发了数据有限条件下动态生物过程建模的双ANN PINN集成框架，状态网络参数化状态变量随时间变化而动力学网络参数化反应速率随状态变量变化，通过平均LOBO-CV数据划分上训练的五折模型构建双ANN PINN集成，并以BSFL衍生富含脂质碳源培养的C. necator PHA生产进行演示；建模结果表明降态双ANN PINN集成准确复现主要过程动态同时保持与底层物料平衡的一致性，状态网络学习可微状态轨迹而速率网络直接从数据推断动力学项而无需预定义经验速率表达式；集成前五折模型平均留出验证R2为0.60，平均五折模型后集成预测总体R2为0.87，物理残差误差从单个折模型的0.0649降至集成后的0.0095，表明学习轨迹与主导平衡方程一致性改善；结果表明集成聚合可降低折依赖变异性同时保持模型的物理信息结构，集成框架提供量化认知不确定性的预测置信区间，可识别过程域中额外实验最具信息量的区域；总体而言本研究提出了数据稀缺条件下动态生物过程建模和认知不确定性估计的物理信息神经网络集成框架，该框架不限于所研究的PHA过程而具有通用性，可容易地适配不同生物过程开发场景。
