《Journal of Autoimmunity》：Cerebrospinal fluid proteome reveals novel biomarkers for differentiating central NPSLE from central nervous system infection
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背景：系统性红斑狼疮（SLE）是一种主要累及育龄期女性的慢性自身免疫性疾病，神经精神表现是其最具破坏性的并发症之一。其中，中枢性神经精神系统性红斑狼疮（cNPSLE）与显著死亡率相关，其发病机制涉及自身抗体和细胞因子介导的神经元损伤、血管病变、血脑屏障破坏及先
背景：系统性红斑狼疮（SLE）是一种主要累及育龄期女性的慢性自身免疫性疾病，神经精神表现是其最具破坏性的并发症之一。其中，中枢性神经精神系统性红斑狼疮（cNPSLE）与显著死亡率相关，其发病机制涉及自身抗体和细胞因子介导的神经元损伤、血管病变、血脑屏障破坏及先天免疫反应激活。尽管临床严重性突出，cNPSLE的诊断仍极为困难：脑活检 rarely feasible，传统临床和影像学工具缺乏诊断特异性；此外，SLE患者接受的免疫抑制治疗显著增加中枢神经系统（CNS）感染风险，这种重叠使临床决策复杂化——早期积极免疫抑制对防止cNPSLE不可逆神经元损伤至关重要，但可能加重隐匿性感染导致危及生命的后果。因此，快速鉴别cNPSLE与CNS感染（cNIC）至关重要。多种循环和鞘内自身抗体（如抗磷脂、抗核糖体P、抗N-甲基-D-天冬氨酸和抗神经节苷脂抗体）与cNPSLE相关，但均缺乏足够敏感性和特异性。脑脊液（CSF）是此目的最具信息量的样本，可直接反映脑内病理并区分自身免疫性炎症与感染。当前诊断方法如CSF测序虽具信息量但耗时且昂贵。既往关于NPSLE的CSF候选生物标志物研究仅两项应用高通量蛋白质组学，均受样本量小、验证不完整及缺乏充分外部重复验证的限制。近年来液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进展使CSF蛋白质组更深层次 interrogation成为可能，尤其数据非依赖采集（DIA）作为下一代LC-MS/MS策略，较传统数据依赖方法具有更优灵敏度和重现性。本研究采用高通量DIA-MS全面分析三组（cNPSLE、cNIC和非疾病对照[NDC]）共2175种CSF蛋白，比较分析Highlight五种蛋白作为潜在生物标志物，随后通过酶联免疫吸附试验（ELISA）在内部队列（46例cNPSLE vs. 29例cNIC）和独立外部队列（40例cNPSLE vs. 13例cNIC）中验证。研究结果支持由MATN3、MERTK和VSIG4组成的三蛋白特征标签的诊断效用，可可靠区分cNPSLE与CNS感染。
研究背景方面，系统性红斑狼疮（SLE）是一种主要影响育龄期女性的慢性自身免疫性疾病，神经精神表现是其最具破坏性的并发症之一。中枢性神经精神系统性红斑狼疮（cNPSLE）与显著死亡率相关，其多因素发病机制包括自身抗体和细胞因子介导的神经元损伤、血管病变、血脑屏障破坏及先天免疫反应激活。然而，cNPSLE的诊断极为困难：脑活检很少可行，传统临床和影像学工具缺乏诊断特异性；同时，SLE患者接受的免疫抑制治疗显著增加中枢神经系统（CNS）感染风险。这种重叠使临床决策复杂化——早期积极免疫抑制对防止cNPSLE不可逆神经元损伤至关重要，但可能加重隐匿性感染导致危及生命的后果。因此，快速鉴别cNPSLE与CNS感染（cNIC）至关重要。多种循环和鞘内自身抗体（如抗磷脂、抗核糖体P、抗N-甲基-D-天冬氨酸和抗神经节苷脂抗体）与cNPSLE相关，但均缺乏足够敏感性和特异性。脑脊液（CSF）是此目的最具信息量的样本，可直接反映脑内病理并区分自身免疫性炎症与感染。当前诊断方法如CSF测序虽具信息量但耗时且昂贵。既往关于NPSLE的CSF候选生物标志物研究仅两项应用高通量蛋白质组学，均受样本量小、验证不完整及缺乏充分外部重复验证的限制。近年来液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进展使CSF蛋白质组更深层次分析成为可能，尤其数据非依赖采集（DIA）作为下一代LC-MS/MS策略，较传统数据依赖方法具有更优灵敏度和重现性。
研究人员开展了多中心研究，采用高通量数据非依赖采集质谱（DIA-MS）全面分析三组共2175种CSF蛋白：cNPSLE患者、CNS感染（cNIC）个体和非疾病对照（NDC）。比较分析Highlight五种蛋白作为潜在生物标志物，随后通过酶联免疫吸附试验（ELISA）在内部队列（46例cNPSLE vs. 29例cNIC）和独立外部队列（40例cNPSLE vs. 13例cNIC）中验证。研究得出由MATN3、MERTK和VSIG4组成的三蛋白特征标签可可靠区分cNPSLE与CNS感染，内部队列曲线下面积（AUC）达0.921，外部队列达0.892。该研究的重要意义在于为解决cNPSLE与CNS感染鉴别这一关键未满足临床需求提供了基于生物学原理的CSF蛋白质组学特征标签，经前瞻性临床评估和跨实验室检测标准化后，该面板可能成为临床判断的快速、廉价辅助手段。
关键技术方法方面，研究人员采用多中心研究设计，包括发现队列和两个验证队列。发现队列（n=39）来自中国医科大学附属第一医院，包括20例cNPSLE、8例cNIC（4例病毒性脑膜炎、3例病毒性脑炎、1例细菌性脑膜炎）和11例无疾病证据的头痛受试者（NDC）。内部验证队列（n=75）由同一中心2018至2023年间招募的46例cNPSLE和29例cNIC患者组成。外部验证队列（n=53）由40例cNPSLE和13例cNIC患者组成，招募自浙江大学医学院附属第二医院和郑州大学第一附属医院。CSF样本采用改良滤器辅助样品制备（FASP）方案处理，DIA-MS在EASY-nano-LC 1200耦合Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪上完成。候选生物标志物采用ELISA验证。统计分析包括ROC曲线分析、二元逻辑回归模型构建复合生物标志物面板、分层bootstrap重采样和留一法分析评估稳健性。
研究结果方面，第一，CSF样本的蛋白质组学特征：研究呈现了三组CSF蛋白质组景观。差异表达蛋白（DEPs）定义为|log2 fold-change| > 1且校正p值 < 0.05。相较于cNIC和NDC，cNPSLE显示显著不同的蛋白质组，115种蛋白（62上调、53下调）显著改变。成对比较显示更广泛的特征：242种DEPs区分cNPSLE与NDC，45种DEPs区分cNPSLE与cNIC，107种DEPs在NDC与cNIC间检测到。利用cNPSLE独有DEPs（n=287）的并集，无监督层次聚类实现cNPSLE患者（16/20，80%）与对照（16/19，84.21%）的良好分离。第二，cNPSLE特异性DEPs的功能富集分析：为分离与cNPSLE病理生物学内在相关的蛋白，研究人员首先将cNPSLE vs NDC对比中识别的242种DEPs与区分cNIC与NDC的107种DEPs取交集，严格排除两种对比间共享的50种蛋白（推测源于CNS损伤而非自身免疫机制）。剩余192种蛋白构成cNPSLE独有特征，与非特异性神经炎症反应基本无关。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析显示集中于B细胞中心自身免疫的分子程序。GO富集强调“免疫反应分子介质的产生”和“免疫球蛋白产生”，直接涉及自身抗体驱动病理。细胞组分术语如“质膜外侧”和“免疫球蛋白复合物”及分子功能注释“抗原结合”和“糖胺聚糖结合” pinpoint SLE中免疫复合物形成不可或缺的细胞外蛋白-配体相互作用。KEGG分析证实并扩展这些观察：细胞黏附分子通路上调支持白细胞跨血脑屏障运输增强作为神经炎症前提的模型；补体和凝血级联平行富集与补体介导组织损伤在狼疮中的既定作用一致；值得注意的是，“碳代谢”和“氨基酸生物合成”同时激活提示浸润免疫细胞的代谢重编程，为CNS微环境中持续过度活跃提供生物能量底物。第三，cNPSLE候选CSF标志物的识别：为提名临床可操作的生物标志物，研究人员将分析限制于表现一致上调的蛋白，因为CSF蛋白浓度 intrinsically低使下调靶标易受分析灵敏度限制和样本间变异导致的假阴性检测影响。因此应用Venn交集识别同时相对于NDC和cNIC在cNPSLE中升高的蛋白，严格过滤产生五种高置信度DEPs。所选候选物ATP6AP2、MATN3、MERTK、VSIG4和IGHV4-34基于其稳健倍数变化和与自身免疫神经炎症的直接病理生理相关性优先考虑。小提琴图证实cNPSLE中所有五种靶标CSF浓度显著更高。为探索这些生物标志物可能的CNS来源，研究人员查询了人类蛋白质图谱（HPA）的单核转录组学数据和独立人类前额叶皮层数据集（GSE104276）。HPA分析将VSIG4和MERTK主要映射至小胶质细胞，而MATN3富集于内皮和神经元谱系。与GSE104276交叉验证证实VSIG4和MERTK的小胶质细胞丰度。值得注意的是，虽然MATN3在HPA图谱中高度富集于内皮细胞，但其在非炎症GSE104276队列内皮簇中表达稀疏，与血管病变条件下特异性诱导的潜力一致。为评估五种候选生物标志物的稳定性，研究人员在发现队列中进行基于重采样的敏感性测试。在分层bootstrap重采样1000次有效重复中，所有五种蛋白在每次被选中的bootstrap样本中均一致相对于cNIC和NDC在cNPSLE中上调。蛋白在38.1–77.8%的重复中满足这些标准。在留一法分析中，每种蛋白保留率为51–97%。两项分析中，所有五种蛋白至少有一项指标超过50%，所有五种候选蛋白进入ELISA验证阶段。第四，内部队列中候选标志物的验证：蛋白质组学衍生的候选物随后在扩展内部队列（46例cNPSLE和29例cNIC）中进行ELISA验证。由于缺乏经过验证的IGHV4-34商业ELISA试剂盒，其余四种蛋白（ATP6AP2、MATN3、MERTK和VSIG4）进入验证。ELISA定量证实MATN3（t=6.91）、MERTK（t=5.21）和VSIG4（t=3.45）在cNPSLE CSF中稳健选择性上调（均P<0.001）。相反，ATP6AP2浓度组间无差异，因此被排除进一步建模。ROC分析显示MATN3（AUC=0.875）、MERTK（AUC=0.801）和VSIG4（AUC=0.724）的强个体判别能力。将三种标志物整合为复合面板进一步将诊断准确性提升至AUC 0.921（95%CI 0.857-0.985）。面板系数在外部验证前锁定。第五，外部队列中候选标志物区分cNPSLE与cNIC的性能：为测试发现的普适性，研究人员在独立外部队列（40例cNPSLE和13例cNIC）中重复ELISA和ROC分析。与内部发现系列一致，cNPSLE中MATN3、MERTK和VSIG4的CSF浓度较cNIC显著升高（MATN3：t=6.19，p<0.001；MERTK：t=3.72，p<0.001；VSIG4：t=3.06，p=0.006）。ROC分析同样显示MATN3（AUC=0.868）、MERTK（AUC=0.775）和VSIG4（AUC=0.752）的强个体判别能力。三蛋白面板再次展现cNPSLE与cNIC间的良好判别性能，应用内部队列锁定的系数时AUC为0.892（95%CI 0.808-0.977）。
讨论部分总结：cNPSLE仍是SLE的主要死亡原因，但其识别因与CNS感染的临床模仿而混淆。接受糖皮质激素或免疫抑制治疗的患者尤其易感机会性病原体，重叠症状如发热、精神状态改变、癫痫发作使经验性免疫抑制危险。因此，诊断不确定性转化为不可逆神经元丢失或危及生命的败血症。循环生物标志物价值有限，因其主要反映外周而非脑内疾病。相比之下，CSF提供CNS特异性病理生理的直接窗口。本研究利用DIA-MS识别和分析2175种CSF蛋白，为cNPSLE中最大蛋白质组覆盖。研究人员识别出三蛋白特征标签（MATN3、MERTK、VSIG4）区分cNPSLE与CNS感染，内部队列AUC为0.921，外部队列为0.892。与既往≤45例患者中分析≤1129种肽段的研究相比，高分辨率方法和两阶段ELISA验证为cNPSLE提供有用的候选生物标志物。192种cNPSLE特异性DEPs集中于三个生物学轴：自身抗体介导损伤、补体驱动血管病变和代谢重编程——强调神经自身免疫的多因素性质。在已验证的生物标志物中，MATN3通过PI3K/AKT/mTOR信号协调细胞外基质（ECM）稳定性，由星形胶质细胞和神经元表达，减弱星形胶质细胞对神经元损伤相关分子模式（DAMPs）的反应性，从而遏制无菌性神经炎症。研究人员推测CSF MATN3升高反映自身免疫攻击开始后限制脑内 collateral damage的补偿尝试。MERTK是TAM家族酪氨酸激酶，调控efferocytosis和氧化还原稳态。虽然传统上归因于巨噬细胞和树突状细胞，小胶质细胞是CNS主要先天免疫细胞。在 murine stroke和人类胶质瘤中，MERTK上调伴随小胶质细胞吞噬爆发。在SLE中，MERTK rs56097910变异与终末期肾病相关，抗dsDNA、抗核糖体P抗体触发海马神经元损伤。因此MERTK升高可能反映抗体介导神经元损伤后的继发性小胶质细胞激活。VSIG4是补体结合B7家族调节因子，抑制组织驻留巨噬细胞激活。在MRL/lpr小鼠中，VSIG4过表达通过淬灭补体过度激活和系膜增生减轻肾炎。与狼疮肾炎中血清和肾脏VSIG4升高一致，其在cNPSLE中CSF上调可能构成 dampen补体介导神经毒性的反调节反应。为检查这些生物标志物在CNS实质内可能的细胞来源，研究人员利用HPA脑单核转录组学数据集和独立人类前额叶皮层单核RNA测序（snRNA-seq）数据集（GSE104276）进行交叉验证。多模态整合证实VSIG4和MERTK在小胶质细胞中的 distinct富集。值得注意的是，虽然HPA数据将MATN3定位至内皮和神经元谱系，但其内皮表达在GSE104276非炎症对照中相对静息。这种差异提示MATN3上调可能是cNPSLE特征性血管病变条件下神经血管单元的特异性应激反应，而非健康CNS的组成性特征。这些发现支持CSF特征标签升高可能反映特异性神经胶质和血管单元激活而非仅仅非特异性血脑屏障渗漏的假说。既往报道提示IgM和M-CSF作为NPSLE候选CSF生物标志物，但这些结论源于小样本（仅8例NPSLE患者）的发现筛选且缺乏充分外部验证，限制其可靠性。本研究分析106例表型良好的cNPSLE患者CSF样本。虽然从小内部验证队列开发的诊断面板易受过拟合影响，但独立外部队列中的持续性能支持可重复性。ELISA数据显示联合MATN3–MERTK–VSIG4特征标签在内部队列中提供复合AUC 0.921。将内部衍生系数未经修改应用于独立外部队列产生AUC 0.892。因此，经前瞻性临床评估和跨实验室检测标准化后，该面板可能为临床判断提供快速廉价辅助。研究局限性包括：队列仅含亚洲血统参与者，向其他族裔群体的普适性需进一步确认；机制解释基于通路富集、既往狼疮生物学和公共单核转录组学资源而非cNPSLE组织直接功能验证；需多中心前瞻性种族多样人群研究确认普适性和生物学机制；本研究主要设计为区分cNPSLE与CNS感染，未纳入自身免疫性脑炎、多发性硬化、视神经脊髓炎谱系疾病、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体相关疾病或原发性CNS血管炎作为对照队列，面板对这些疾病的特异性需进一步研究；无神经精神表现的活动性SLE患者未纳入，因临床实践中腰椎穿刺非常规指征且CSF样本采集困难；未观察到CSF生物标志物浓度与SLEDAI-2K的关联，提示这些标志物可能反映CNS受累而非整体SLE疾病活动性；未检测到生物标志物水平与糖皮质激素暴露或采样时泼尼松等效日剂量的显著关联，但因大多数cNPSLE患者采样时已接受糖皮质激素治疗，未治疗患者较少可比较，治疗对生物标志物的影响不能完全排除，需前瞻性研究阐明。
研究结论翻译：总之，本研究通过识别和验证基于生物学原理的CSF蛋白质组学特征标签（MATN3、MERTK、VSIG4），解决了区分cNPSLE与CNS感染的关键未满足需求。该面板达到有前景的诊断准确性，在内部和独立外部队列中保持稳健判别。需更大规模多中心队列进行后续验证。
