《Journal of Engineering Research》：Tunable Network Structure and Moisture Management in Freeze -Thaw PVA/Whey Protein Isolate Fibril Biphasic Dressings
编辑推荐：
尽管在开发皮肤创面敷料方面已取得显著进展，但设计兼具适当物理性能、渗出液管理能力、结构稳定性及细胞生物相容性的敷料仍具挑战性。本研究利用气凝胶与水凝胶的双重优势，开发了两相凝胶敷料，并研究了添加不同负载量的乳清蛋白分离物纤维（WPIF）作为PVA基质生物增强剂
尽管在开发皮肤创面敷料方面已取得显著进展，但设计兼具适当物理性能、渗出液管理能力、结构稳定性及细胞生物相容性的敷料仍具挑战性。本研究利用气凝胶与水凝胶的双重优势，开发了两相凝胶敷料，并研究了添加不同负载量的乳清蛋白分离物纤维（WPIF）作为PVA基质生物增强剂的效果。为此，研究人员在酸性pH下加热乳清蛋白溶液，然后将乳清蛋白分离物纤维以1%、3%和5%的浓度添加至PVA溶液中。均质化后，样品经过冻融循环形成物理连接，随后进行冷冻干燥。结果表明，WPIF在调控敷料的理化、形态及生物学性能方面起关键作用。尽管添加WPIF并未从根本上改变PVA基体的半结晶结构，但确实影响了其玻璃化转变温度、形貌、溶胀行为、流变响应及水分管理性能。与纯PVA相比，复合材料的吸水能力和溶胀值提高至488%。此外，MTT分析显示，暴露于PVA-WPIF提取物的细胞在72 h后的代谢活性可达对照组的约162%。本研究提示，WPIF负载可实现WPIF负载水平的调控及内部结构的调整。该技术结合其低成本生产和产业化潜力，预示着创面敷料在组织再生领域具有广阔前景。
皮肤作为人体最大的器官，是抵御细菌和病毒的首要防御屏障，同时具有调节体温、排泄废物和呼吸等功能。由于皮肤位于机体最外层，极易受到机械损伤、化学暴露、物理创伤和环境应激的影响。屏障受损可损害基本保护功能、增加感染风险，并可能引发危及生命的状况。创面是由物理、热或生理因素导致的皮肤破损或缺损。通常，急性创面在8至12周内无瘢痕愈合，而慢性创面则需要超过12周。创面是重大的医疗挑战，带来显著的社会经济负担和高额医疗费用；仅在美国，慢性创面影响超过2%的人口，每年花费约200亿美元。创面愈合过程由高度调控、相互重叠的步骤组成，包括止血、炎症、迁移、增殖和真皮重塑。传统敷料如纱布、棉布、绷带、泡沫或缝合器闭合创面主要提供被动保护，但缺乏保湿和充分的渗出液管理能力。此外，换药时的疼痛和二次损伤、与新肉芽组织粘连或机械适应性不足可增加微生物感染风险。理想的敷料应在吸收多余液体和渗出液的同时，创造并维持最佳湿润愈合环境，还应无毒、具有生物相容性，具备足够的机械强度和弹性以适应不规则创面表面并保持完整性，允许气体渗透并防止二次感染。为克服传统敷料的局限性，临床焦点已转向水凝胶和气凝胶等先进材料。
水凝胶是由物理或化学交联形成的三维聚合物网络。由于其高亲水性，可在结构中储存大量水的同时保持网络完整性。由于具有丰富的官能团和可调交联性，其水合多孔结构具有可调的物理性能。在物理化学性质方面，水凝胶类似生物组织，因为其水合和多孔结构密切模拟细胞外基质（ECM）微环境。水凝胶可由支持细胞增殖但机械强度较弱的天然聚合物制成，也可由强度较高但一般缺乏细胞黏附性的合成聚合物制成，两者结合可产生协同效应。在功能上，水凝胶已被证明可通过创造湿润局部环境来增加上皮化速率并加速愈合。其可溶胀的多孔结构可吸收创面渗出液、清除代谢物并促进细胞黏附、迁移和增殖。此外，水凝胶允许氧气渗透，在吸收多余渗出液的同时防止重要体液流失。在临床研究中，水凝胶已被证明可作为抵御细菌的物理屏障，并根据其组成表现出额外的生物学效应。水凝胶易于更换，通常在更换过程中不会造成二次损伤，并可均匀覆盖不规则创面。这些特性使其广泛应用于皮肤缺损、感染创面、烧伤、糖尿病足甚至湿润的内部创面。水凝胶结构也是负载药物、细胞或生物活性分子的天然合适载体，可通过改性赋予抗菌、抗炎、止血、免疫调节和组织黏附功能。然而，传统水凝胶面临吸收缓慢、灭菌困难和使用不便等挑战。因此，双相气凝胶-水凝胶敷料是一种新兴策略，其中气凝胶的干燥多孔状态便于灭菌和储存；同时，接触血液或高渗出创面可刺激快速液体吸收，随后转化为水凝胶，保留渗出液并有助于维持清洁的创面微环境。然而，与直接制备的水合水凝胶相比，该方法需要额外的干燥步骤（通常为冷冻干燥）以生成并保持干燥多孔结构。
聚乙烯醇（PVA）是一种合成水溶性多羟基聚合物，具有半结晶结构，因其耐化学性和易加工性而被广泛使用。由于其生物相容性、生物降解性、无毒、非致癌性和非免疫原性，该聚合物被认为是一种生物医学聚合物。除安全性外，它还具有亲水性、耐热性和机械强度。一般而言，稳定的水凝胶通过化学交联形成，化学交联高度稳定但可能需要潜在有毒的交联剂并带来健康风险；也可通过物理交联形成，物理交联依赖于非共价相互作用，如羟基间的氢键、离子相互作用、金属配位、结晶和疏水相互作用。冻融是一种重要的物理交联方法，其明显优势在于消除了化学方法相关的毒性浸出。冻融过程通过连接区连接聚合物链，其中链在一定长度上相互作用形成微晶，而非通过点连接；同时，水作为致孔剂，形成互连的多孔结构网络。尽管具有这些优势且纯PVA水凝胶在创面敷料和其他领域广泛应用，但纯PVA水凝胶可能存在局限性，包括柔韧性有限、弹性低、成膜硬、缺乏生物活性以及细胞黏附性和蛋白质摄取差。在冻干过程中，网络微结构可能收缩和塌陷，对营养渗透和细胞存活产生不利影响。因此，研究人员提出将PVA与明胶或壳聚糖等天然聚合物结合以改善细胞相容性。
乳清蛋白分离物（WPI）是一种高度纯化的蛋白质材料（蛋白质≥90%），作为乳制品加工的副产品大规模生产。由于其高可用性和有竞争力的价格而受到关注。在WPI中，酪蛋白、脂质、碳水化合物和乳糖被去除，其主要成分是β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。基于WPI的系统已被报道具有生物降解性、生物相容性、低毒性、可灭菌性和细胞相容性。此外，WPI含有多种必需和非必需氨基酸，包括谷氨酰胺——细胞生长的必需成分，支持其用于为细胞存活提供相容基质的复合水凝胶创面敷料。除凝胶化、亲水性和柔韧性外，WPI已被报道可与聚合物结合以增强性能和功能特性，为生物医学材料开辟新的设计机会。WPI可自组装成直径约10 nm的超分子纤维。在这种情况下，在强酸性条件和低离子强度下加热至变性温度以上数小时后，形成高长径比的纤维结构。这些结构可专门用于流变学改性和作为活性剂递送系统的基质。虽然WPI已以各种形式（包括薄膜和食品应用）得到广泛研究，但其在生物医学应用特别是创面敷料中的潜力尚鲜为人知。仍需要若干研究和框架来支持结构-性能应用。为填补这一空白，本研究探讨了WPIF在水凝胶创面敷料设计中的结构和功能作用。
在本工作中，研究人员仅使用冻融方法、不添加任何化学交联剂，成功制备了PVA与乳清蛋白分离物纤维（WPIF）复合敷料。研究人员研究了1 wt%、3 wt%和5 wt% WPIF负载的影响，以帮助填补WPI在生物医学应用中使用的空白。对所有制备的敷料进行了全面研究，包括分子间相互作用、形貌、黏弹性流变性能和热性能。此外，体外研究了气凝胶-水凝胶双相（AHB）敷料的水蒸气透过率和稳定性。为评估生物相容性，研究人员使用MTT法测量细胞活力，以评估其在皮肤组织再生中的初步和潜在应用。这些研究表明，具有可调控网络结构和水分管理性能的冻融PVA-WPIF-AHB是创面敷料和皮肤组织工程的有前景平台。
在材料制备方面，PVA（平均Mw 130000，99+%水解）购自Sigma-Aldrich，WPI（纯度>90%）购自Hilmar Industries（美国）。WPIF的制备方法改编自先前报道的方法并稍作修改：将6 g WPI粉末磁力搅拌溶于100 mL Milli-Q水中1 h，经0.22 μm Millipore注射器过滤器过滤，将透明WPI溶液用HCl酸化至pH 2，转移至密封装置中于90°C加热5 h，冰水浴冷却20 min后于4°C储存备用。PVA-WPIF-AHB敷料通过5次冻融循环后冷冻干燥制备：将PVA以10 wt%溶于蒸馏去离子水中，于90°C磁力搅拌1 h至均相；用NaOH溶液将WPIF调至pH 7.4，在剧烈搅拌下与PVA溶液混合，制备含1、3、5 wt%乳清蛋白（相对于复合物总重量）的混合溶液；超声浴去除气泡后转移至培养皿，于-70°C冷冻22 h，室温解冻2 h，真空冷冻干燥24 h。
在表征方法方面，采用衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）在400–4000 cm?1范围内评估冻干样品的官能团，WPIF的酰胺I区经基线校正后用高斯组分拟合去卷积；采用X射线衍射（XRD）以0.154 nm入射波长在10°–70°衍射角范围内分析结晶相；采用差示扫描量热法（DSC）在氮气气氛下以10 °C/min加热评估热性能，Tg取中点，Tm取第二次升温扫描中熔融吸热峰最大值；采用扫描电子显微镜（SEM）观察冻干样品经液氮脆断和喷金后的微观结构和内部形貌，并用Fiji图像分析软件估算表观孔径分布和孔面积分数；采用流变力学光谱（RMS）和Anton Paar平行板流变仪（MCR300，奥地利）评估水凝胶态的黏弹性，测量储能模量（G′）和损耗模量（G″），频率扫描固定应变0.5%、频率0.1–100 rad s?1，流动曲线剪切速率0.01–100 s?1；按ASTM E96测定水蒸气透过率（WVTR）；采用常规重量法评估溶胀性能；通过浸泡于37°C PBS（pH 7.4）中21天检测体外质量损失；使用L-929细胞通过MTT还原法评估细胞活力；采用方差分析（ANOVA）及Tukey多重比较检验进行统计分析，p<0.05认为差异具有统计学意义。
研究结果方面，在结构与热性能部分，FTIR-ATR光谱显示3200–3600 cm?1宽峰对应PVA羟基的OH伸缩振动，也包含WPIF的NH振动和其他极性基团；随着WPIF负载增加，峰形轻微变化表明PVA羟基的化学环境改变，提示PVA与WPIF官能团间可能形成分子间相互作用特别是氢键。2940–2850 cm?1 band归因于PVA有机链的C-H伸缩，所有样品中这些band的存在表明WPIF添加后原始PVA链结构得以保持。1500–1700 cm?1范围内酰胺I和酰胺II峰主要归因于肽结构中C=O伸缩、N-H弯曲和C-N伸缩，出现在含WPIF样品中并随负载增加而相对增强。酰胺I区去卷积解析出约1621、1646和1673 cm?1三个组分，其中1621 cm?1低波数组分与分子间富含β-折叠的蛋白质组装体一致，为所应用纤维化条件下形成的有序蛋白质结构提供光谱支持。1400 cm?1峰可归因于PVA链相关的CH?和C-O弯曲及C-H变形模式，所有样品在1100 cm?1显示C-O和C-C伸缩相关band。无 distinct 新吸收带表明无明确光谱证据支持新共价键形成，提示PVA与WPIF之间的结合主要为物理作用。XRD图谱中所有样品在2θ=19.4°附近出现明显衍射峰，归因于PVA结晶区，连同2θ=39.9°附近弱反射表明PVA的半结晶性质；复合样品中主峰位置几乎不变表明蛋白质相的添加未引起PVA晶体结构的根本变化或形成 distinct 结晶相，但峰形、强度和宽度的变化提示WPIF可能影响PVA基质内的结构有序度，可能源于PVA羟基与WPIF胺基间的分子间相互作用特别是氢键。DSC结果显示添加1% WPIF未显著影响Tg，纯PVA和PVA-WPIF1的Tg均接近79°C；将WPIF含量增至3%和5%时Tg分别降至73.9°C和66.3°C，表明WPIF影响PVA链迁移性的能力取决于负载量。较高负载水平下蛋白质纤维可表现出类增塑效应，增加基质迁移性。样品Tm保持相对较窄范围157.8–161.4°C，表明WPIF虽改变非晶相迁移性但未显著影响剩余富PVA结晶域的热稳定性。
在多孔形貌部分，SEM显示所有样品均具有多孔结构，但WPIF含量影响表观孔隙率、孔径和分布均匀性。纯PVA样品的表观孔面积分数为44.65%，添加1%和3% WPIF分别增至47.66%和51.89%，平均孔径也从纯PVA的1.64 μm增至PVA-WPIF1的1.69 μm和PVA-WPIF3的2.11 μm，表明添加适量WPIF特别是3%负载可获得更多孔形貌。相反，将WPIF含量增至5%显著降低表观孔面积分数至37.03%，平均孔径也降至1.35 μm，表明较高WPIF负载可能导致更致密网络、更小孔或限制多孔结构发展；PVA-WPIF5样品的高变异系数（CV）约116%表明孔径分布更不规则。孔径分布也证实这一趋势：所有样品中大多数孔直径小于4 μm，但PVA-WPIF3样品显示比其他样品更高比例的大孔，4–8 μm孔比例从纯PVA的5.59%增至PVA-WPIF3的9.66%，8–12 μm孔比例也高于其他样品，与其中位和平均孔径较高一致，表明PVA-WPIF3具有比纯PVA更发达的多孔形貌。相反，PVA-WPIF5样品显示最高比例小于4 μm的孔（95.30%）和最低比例4–8 μm孔，与较高WPIF负载下表观孔隙率降低和结构更致密一致。
在流变网络行为部分，频率扫描测试显示所有配方的储能模量G′均大于损耗模量G″，弹性响应主导黏性响应，表现出凝胶状和固体状性质。纯PVA样品显示比含WPIF样品更高的G′值，可能源于冻融循环期间形成的相对致密弹性PVA网络；添加WPIF降低G′表明蛋白质相的引入特别是低水平时可部分破坏PVA链排列、PVA-PVA相互作用和物理网络连接区的形成。然而，在含WPIF样品中，G′随WPIF含量从1%增至5%而增加，表明较高WPIF负载部分恢复了黏弹性响应特别是弹性贡献，尽管所有含WPIF样品仍不如纯PVA僵硬；这种部分恢复可能归因于WPIF与PVA链间额外的物理相互作用，改善有效网络连接性并促进杂化PVA-蛋白质物理网络形成。G″和tan δ行为也证实网络动态性质的变化：在相当一部分频率范围内，含WPIF样品特别是PVA-WPIF3和PVA-WPIF5显示比纯PVA更高的耗散贡献，可能源于更高的局部链迁移性、可逆物理相互作用或PVA-WPIF界面处的能量耗散；但所有样品tan δ值均小于1，表明所有配方中弹性行为主导。纯PVA显示最低tan δ，因此具有最弹性主导的网络；PVA-WPIF3显示较高tan δ值，表明更具动态性和更大能量耗散的网络。所有样品的表观黏度随剪切速率增加而显著降低，反映水凝胶的剪切变稀性质，增强可变形性、操作性和对创面表面的适应性。PVA和PVA-WPIF5在低剪切速率下比其他样品具有更高黏度，表明更大流动阻力和更强物理网络形成；相反PVA-WPIF1在宽剪切速率范围内显示最低黏度，与频率扫描数据和G′降低一致。总体而言，流变结果表明所有制备的水凝胶具有凝胶状、弹性主导和剪切变稀行为，添加WPIF以负载依赖方式影响网络响应：低量WPIF降低网络刚度，而较高量部分恢复弹性响应和流动阻力。
在流体管理与体外质量损失部分，纯PVA样品的WVTR值约为4000 g m?2 day?1，而PVA-WPIF1、PVA-WPIF3和PVA-WPIF5样品的WVTR值分别约为5200、6110和5790 g m?2 day?1，表明添加WPIF相比纯PVA增加了水蒸气渗透性。溶胀行为显示所有样品在前30分钟内快速吸水，溶胀比为240–263%，归因于气凝胶的多孔结构；随时间推移所有样品吸水增加，但含WPIF样品显示比纯PVA更高的吸收能力。纯PVA的平衡溶胀比约为380%，而PVA-WPIF1、PVA-WPIF3和PVA-WPIF5分别约为433%、457%和488%，表明蛋白质纤维可增强PVA网络的吸水和保水能力。大部分吸水发生在前6小时，24小时接近平衡溶胀，72小时无显著变化。PVA-WPIF5在干态下表观孔面积分数低于PVA-WPIF3，但其更高溶胀值表明该系统的吸水并非仅由干态形貌控制，溶胀行为由表观孔隙率和化学亲水性共同决定。质量稳定性评估显示纯PVA样品在PBS中21天后未显著失重，表明PVA物理网络高度稳定；相反WPIF负载加速了失重。PVA-WPIF1直至第7天几乎稳定，但第14天失重达8.3%，第21天达13.3%。PVA-WPIF3样品第7天开始失重，从第7天的6.25%增至第14天约18.75%和第21天20.24%。PVA-WPIF5样品失重最高，第3天开始初始失重，第14天和第21天分别达约20.2%和25%。增加WPIF含量可能导致更大失重，因为蛋白质相更亲水且PBS更易渗透网络，可能促进较不稳定网络区域的降解或物理侵蚀以及松散结合蛋白质组分的溶解或浸出。尽管含WPIF样品存在失重，水凝胶网络在21天孵育后仍保持宏观完整性。
在组织工程与创面敷料应用部分，MTT法用于验证AHB凝胶敷料提取物的体外生物安全性。纯PVA配方24小时后细胞活力约为69%，72小时后降至约31%。添加1% WPIF较纯PVA改善细胞活力，PVA-WPIF1样品24小时后活力约84%，72小时后约65%。随WPIF负载增加活力显著改善：24和72小时PVA-WPIF3活力分别为108%和115%。PVA-WPIF5样品在两个时间点均显示最高活力，24小时约127%，72小时约162%。PVA-WPIF3和PVA-WPIF5高于100%对照线的值表明这些样品相比对照增加了细胞代谢活性。基于MTT结果，WPIF掺入以负载依赖方式增加L929细胞的相对代谢活性，最佳细胞响应见于PVA-WPIF3特别是PVA-WPIF5，提示AHB敷料中较高WPIF水平适合创面敷料应用。
讨论部分总结如下：研究人员采用仅含热辅助纤维形成、冻融循环和冷冻干燥的简单工艺、不添加化学交联剂，开发了基于PVA和WPIF的AHB敷料。结果表明，向PVA基质中添加WPIF以负载依赖方式影响敷料的理化和生物学性能，包括形貌、溶胀行为、降解、流变性能和细胞活力。相反，热研究表明Tg变化连同Tm相对稳定和主XRD峰位置表明WPIF主要影响PVA的非晶/界面相，而未从根本上改变PVA基体的半结晶结构。添加WPIF增加了吸水能力。此外，MTT结果表明较高WPIF负载特别是PVA-WPIF3和PVA-WPIF5在所测试条件下导致比纯PVA配方更高的细胞活力。尽管增加WPIF水平与PBS中更大质量损失相关，但即使孵育21天后，最高WPIF负载的样品仍保持宏观完整性。在材料设计方面，将WPIF与PVA并用提供了一种简单、低成本、易获得的蛋白质基方法来开发多孔敷料；蛋白质纤维还可增加亲水性并改善细胞响应，同时允许调节溶胀行为、质量稳定性和网络黏弹性。此外，由于WPIF结构含有官能团和氨基酸基团，该系统可为化学或物理改性、负载治疗化合物、控制药物释放以及与纳米颗粒和其他生物活性材料结合以设计更多功能和靶向敷料提供未来途径。因此，本研究表明PVA-WPIF敷料是创面敷料应用的有前景平台，但该系统的实际开发仍需进一步的生物相容性研究。
