《American Journal of Rhinology & Allergy》：A Pilot Study on the Relationship Between Time to Formalin Fixation and Changes in Eosinophil Infiltration in Nasal Polyps
编辑推荐：
背景：组织嗜酸性粒细胞计数通常被用作慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）的预后标志物，并根据既定标准确定经济援助资格，其重要性日益凸显。然而，目前尚无标准化方案规范从标本采集到甲醛固定的处理流程。这一实践空白具有临床意义，因为固定前延迟对嗜酸性粒细胞计数和上皮完
背景：组织嗜酸性粒细胞计数通常被用作慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）的预后标志物，并根据既定标准确定经济援助资格，其重要性日益凸显。然而，目前尚无标准化方案规范从标本采集到甲醛固定的处理流程。这一实践空白具有临床意义，因为固定前延迟对嗜酸性粒细胞计数和上皮完整性的影响尚不明确。目的：确定甲醛固定时间是否影响CRSwNP患者鼻息肉中的嗜酸性粒细胞计数和上皮完整性。方法：通过本机构标准外科病理工作流程处理的临床鼻息肉标本及受控研究方案处理的标本，采用苏木精-伊红染色进行组织学评估。对于临床标本，记录从采集到固定的时间并对嗜酸性粒细胞进行计数。在实验部分，研究标本在切除后0 h、1天、3天和7天进行切片和固定。比较不同时间间隔的嗜酸性粒细胞计数和上皮损伤评分，并与固定延迟进行相关性分析。结果：甲醛固定时间范围为51 min至19 h，较长延迟与更大的嗜酸性粒细胞减少相关（r = ?0.867，p = .057）。在实验部分，1天、3天和7天的嗜酸性粒细胞计数低于0 h（p < .05），固定时间与嗜酸性粒细胞计数呈负相关（r = ?0.39，p < .05）。上皮损伤评分在1天、3天和7天增加（p < .05），并与固定时间呈正相关（r = 0.72，p < .05）。结论：延迟甲醛固定会减少鼻息肉中的嗜酸性粒细胞计数并恶化上皮保存。组织处理和固定时间的标准化可能提高CRSwNP患者组织学嗜酸性粒细胞评估的可靠性。
慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）是一类以鼻腔和鼻窦黏膜慢性炎症为特征的疾病，其中嗜酸性粒细胞浸润在多数病例中发挥重要作用。组织内嗜酸性粒细胞数量常被用于评估疾病严重程度和预后，且被认为比其他因素（如症状严重程度、影像学表现和血液检测结果）更能预测疾病严重程度。既往研究表明，高嗜酸性粒细胞浸润的鼻息肉显著预测高复发风险。此外，组织嗜酸性粒细胞增多与广泛的鼻窦病变、疾病特异性生活质量改善较差以及更高的术后症状评分相关。组织嗜酸性粒细胞计数还被用作获得医疗经济支持的治疗资格标准之一。鉴于嗜酸性粒细胞浸润对疾病严重程度的明确影响，嗜酸性粒细胞计数在指导CRSwNP临床管理中具有重要意义。嗜酸性粒细胞计数已被用作皮质类固醇反应预测因子和2型炎症靶向生物制剂资格判定依据。不同机构分析了浸润嗜酸性粒细胞数量与临床结局之间的关系，然而所采用的分级标准因地区和国家而异。比较临床结局与组织嗜酸性粒细胞计数的报告表明，亚洲国家在确定与不良预后相关的因素时倾向于使用较高的截断值，而西方国家采用较低的截断值。这一差异究竟反映真实的生物学差异，还是部分源于组织处理实践差异所导致的伪影，目前尚不清楚。
在临床实践中，手术标本通常送至病理科由病理学家进行组织学诊断和评估。一些机构在手术室内即开始甲醛固定后再运送，而其他机构则可能将标本浸泡于生理盐水中运送。因此，组织切除与甲醛固定之间的时间间隔因机构而异。既往多项研究报道，甲醛固定前 prolonged 延迟会导致进行性组织坏死并伴随浸润白细胞数量减少。重要的是，目前尚无标准化方案规范从息肉采集到甲醛固定的标本处理流程，这代表了组织学嗜酸性粒细胞评估中一个潜在重要且未被充分认识的可变性来源。
研究人员假设固定前处理时间的变异是导致不同机构和地区间嗜酸性粒细胞截断值差异的一个促成因素。值得注意的是，在研究人员所在机构，手术鼻息肉标本从手术室送至病理科时浸泡于生理盐水中，随后在病理科进行甲醛固定。本研究首先调查了鼻息肉手术切除至病理科标本甲醛固定时间与组织浸润嗜酸性粒细胞数量之间的关系。基于初始数据结果，研究人员开展了离体实验，旨在阐明息肉标本采集与甲醛固定之间时间变化所引起的组织学改变。本研究发现在临床实践和鼻科研究中组织处理方案标准化方面具有直接意义。
研究人员开展了以下研究：纳入9例经鼻内镜诊断为鼻内息肉、影像学排除肿瘤性病变并接受功能性内镜鼻窦手术（FESS）治疗CRSwNP的患者（平均年龄41.2 ± 15.0岁；范围16-54岁；6男3女）。其中2例患者分别切除2个息肉，每个息肉用于研究的不同部分。3例患者仅提供临床标本部分样本，4例患者仅提供研究标本部分样本。因此，5例患者的息肉用于临床部分，6例患者的息肉用于实验部分。临床标本部分：5例CRSwNP患者（35.4 ± 17.4岁，范围16-54岁，2男3女）接受FESS切除的鼻息肉用于本研究。每个切除息肉分为2部分；一部分按标准临床方案浸泡于生理盐水（0.9% NaCl）中送至病理科，另一部分在手术室内直接进行甲醛固定后送至病理科。由一名外科病理学家记录盐水运送息肉的采集至甲醛固定时间及固定前储存条件，随后由同一病理学家对两组标本的嗜酸性粒细胞计数进行计数。确定嗜酸性粒细胞密度最高的区域，计数4 mm2视野内的嗜酸性粒细胞数量。实验研究标本部分：6例CRSwNP患者（46.3 ± 10.1岁，范围31-54岁，4男2女）接受FESS无创切除的鼻息肉用于研究。每个切除息肉首先分为3块和6等份标本，并标记待评估的特定横截面。第一份标本在分割后立即进行甲醛固定（0 h），其余切片分别在切除后1天、3天和7天进行甲醛固定。固定前，标本浸泡于生理盐水中并保持室温。固定标本石蜡包埋，5 μm厚度切片，苏木精-伊红（H&E）染色。使用VS200研究玻片扫描仪（Olympus）捕获数字图像，使用OlyVIA Viewer软件（Olympus）生成单张图像。全标本检查在2倍放大下进行，嗜酸性粒细胞浸润和黏膜上皮评估在400倍放大下进行。嗜酸性粒细胞定义为具有双叶核和胞质内嗜酸性颗粒的细胞。与既往文献一致，选择浸润最普遍的3个区域进行嗜酸性粒细胞计数并计算均值。上皮形态学评估采用基于文献描述的4级评分系统，该文献描述了长期浸泡于生理盐水导致的组织变性。评分标准如下，计算3个区域均值以确定1份标本的黏膜上皮损伤评分：3—细胞结构完全溶解和消失，2—黏膜上皮结构完整性丧失，1—黏膜上皮内广泛细胞空泡化，0—观察到完整的假复层纤毛上皮。研究标本的嗜酸性粒细胞计数和黏膜上皮损伤评分由单一评估者测定。
主要关键技术方法包括：临床标本队列来源于研究人员所在机构接受FESS的CRSwNP患者，采用Wilcoxon符号秩检验（单侧）比较手术室内甲醛固定标本与生理盐水运送后病理科甲醛固定标本之间的差异，采用Pearson相关分析（双尾检验）确定甲醛固定时间与该计算差异之间的相关系数和p值。实验标本采用单因素方差分析（Holm-Sidak多重比较检验）和Wilcoxon符号秩检验（单侧）分析嗜酸性粒细胞计数和上皮损伤评分，采用Pearson相关分析（双尾检验）评估甲醛固定时间与嗜酸性粒细胞计数或上皮损伤评分之间的关系。使用PRISM软件（版本11）进行统计分析，R软件（版本2026）进行绘图。
结果部分：手术室与病理科甲醛固定及组织嗜酸性粒细胞计数—临床部分。所有经生理盐水运送至病理科的标本在甲醛固定前均储存于室温；标本采集至甲醛固定的时间范围为51至1144 min（337.6 ± 457.6 min）。手术室内甲醛固定标本的嗜酸性粒细胞计数（446.6 ± 439.4）与生理盐水运送后病理科甲醛固定标本（384.4 ± 479.6）之间未观察到统计学显著差异（p = .225）。甲醛固定时间与嗜酸性粒细胞计数差异（计算为病理科固定标本嗜酸性粒细胞计数减去手术室固定标本计数）之间观察到高度负相关（r = ?0.867，p = .057），但未达到统计学显著性。甲醛固定与组织学改变—实验部分。尽管在采集后0 h、1天和3天组织样本中可识别嗜酸性粒细胞，但第7天可识别嗜酸性粒细胞数量显著减少，嗜酸性颗粒染色强度减弱。0 h固定的组织标本中观察到纤毛黏膜上皮；然而，在1天或更晚固定的标本中，上皮形态进行性改变，许多区域上皮细胞缺失。与0 h固定标本（n = 6，38.7 ± 21.7）相比，1天（n = 12，17.0 ± 15.3）、3天（n = 12，20.0 ± 15.1）和7天（n = 6，5.9 ± 5.5）固定标本的嗜酸性粒细胞计数显著降低（Holm-Sidak校正p = .030、.034和.006）。与0 h时间点（n = 6，0.4 ± 0.4）相比，黏膜上皮损伤评分在第1天（n = 12，1.8 ± 0.6）、第3天（n = 12，2.7 ± 0.5）和第7天（n = 6，3.0 ± 0.0）进行性增加（Holm-Sidak校正p = 8.2 × 10
?5、6.8 × 10
?8和4.4 × 10
?8）。值得注意的是，所有6份标本在第7天均获得最大损伤评分3。横截面分析同样显示从切除时至第1天以及从第3天至第7天嗜酸性粒细胞计数减少，上皮损伤评分从切除至第1天相应增加。甲醛固定前时间与组织嗜酸性粒细胞数量之间观察到负相关（r = ?0.394，p = .0174）。黏膜上皮损伤评分同样随固定延迟而增加（r = 0.719，p = 7.82 × 10
?7）。
讨论部分总结：组织嗜酸性粒细胞计数在CRSwNP的诊断、预后分层以及日益重要的治疗中占据核心地位。影响预后和治疗选择的因素不仅包括哮喘和NSAID过敏等病史，还包括组织内存在的炎症细胞数量。组织内嗜酸性粒细胞计数被认为是CRSwNP比症状严重程度、术前计算机断层扫描（CT）评分、息肉大小、合并哮喘、过敏状态、外周血嗜酸性粒细胞增多和黏附分子表达等其他因素更重要的预测因子。除预后判断外，嗜酸性粒细胞计数具有直接治疗意义——在包括日本在内的一些国家，它们作为确定高成本干预（如生物制剂治疗和手术经济援助项目）资格的门槛标准，组织嗜酸性粒细胞计数超过预定截断值也是确定医疗治疗补贴资格的因素之一。随着特定生物标志物分析的不断进展，组织驻留嗜酸性粒细胞的评估因其相对简便和临床实用性而仍然是一种广泛使用的方法。研究人员假设组织采集至甲醛固定时间的变异可能改变嗜酸性粒细胞计数。本研究结果显示，在实际临床实践中，组织标本偶尔在生理盐水中储存相对较长时间后才进行组织固定。实验表明，组织采集后仅24 h内即可发生可测量的嗜酸性粒细胞计数减少和黏膜上皮变性——完全在常规临床条件下观察到的延迟范围内。这提出了一个临床重要问题：如果固定延迟系统性减少嗜酸性粒细胞计数，患者可能在疾病严重程度、预后和治疗资格方面被错误分类。在嗜酸性粒细胞阈值直接决定生物制剂治疗可及性的地区，次优的组织处理可能导致患者未能达到在标准化条件下本可满足的标准。手术采集组织标本的处理方案因国家或地区以及具体临床环境（如门诊与手术室）而存在显著差异。关于甲醛固定时间的方案也差异很大。一些方案规定采集后立即浸泡，其他规定手术完成后进行，还有一些指出仅在标本送至病理科后进行固定。理想情况下，甲醛固定应在标本采集后30 min内进行，因为该过程延迟可导致组织变性，从而降低染色效率并可能损害诊断准确性。Douglas等人先前开展的一项研究调查了血栓标本采集后生理盐水浸泡时长与后续组织学发现之间的关系，报道在24 h内发生足以影响软件分析定量评估的显著组织变性。本研究将这些发现扩展至CRSwNP鼻息肉组织，代表该特定背景下首次此类分析。在临床标本队列中，每例甲醛固定均在切除后超过30 min才开始，其中一例延迟至切除后19 h。尽管样本量有限，但观察到固定延迟与嗜酸性粒细胞计数减少之间的强负相关（r = ?0.867，p = .057），趋势接近但未达到统计学显著性——这一发现与有意义的生物学效应一致，值得在更大队列中确认。与实验部分不同，本研究采用观察视野内嗜酸性粒细胞浸润最密集区域的测量值。既往发表文献中组织嗜酸性粒细胞计数方法各异，目前对于CRS中嗜酸性粒细胞增多的定义尚无共识——包括评估视野数量以及使用显微镜观察还是捕获图像等因素。在本研究中，未建立统一方法，因为临床部分和实验部分的评估者不同，导致其最佳嗜酸性粒细胞计数方法存在差异。这一经验再次确认了建立跨不同医学专业认可的标准化嗜酸性粒细胞计数方法的重要性。在实验部分，与0 h固定标本相比，1天、3天和7天的嗜酸性粒细胞计数显著降低，且在所有延迟时间点观察到黏膜上皮损伤进行性增加。与研究人员初始预期相反，嗜酸性粒细胞在生理盐水中浸泡长达3天的标本中仍可识别；然而，即使在24 h，定量计数也显著减少。这表明仅依赖嗜酸性粒细胞的存在是不够的——可计数细胞的减少远在完全消失之前就已开始，而具有诊断和预后权重的是计数，而非简单的可检测性。既往研究报道约1天后观察到白细胞变性，1周时发生进一步组织变性。尽管此前无研究调查鼻息肉中甲醛固定前时间与嗜酸性粒细胞计数之间的关系，研究人员设立了3天延迟期以模拟临床实践中可能发生的情景，如组织在周末未被处理，并将超过2周的延迟期排除在实验之外，因为这在实际临床环境中不太可能发生。结果显示，与既往白细胞研究相似，嗜酸性粒细胞变性最早在采集后1天即开始。未来以更精细时间增量（以小时计）进行的实验将允许更精确地确定显著嗜酸性粒细胞变性的阈值。值得注意的是，所有标本在第7天均获得最大上皮损伤评分，强调了延迟固定对组织完整性的进行性和不可逆性。迄今为止，尚未建立CRSwNP患者采集的鼻息肉标本的标准化固定方案。本研究结果为跨机构和地区制定和采用此类方案提供了有力依据。本研究的局限性在于样本量小；因此，本工作定位为先导研究。此外，在患者选择方面，研究人员未特意选择以强烈嗜酸性粒细胞浸润为特征的患者——如合并哮喘或嗜酸性粒细胞增多者。未来研究可通过采用预测更强嗜酸性粒细胞浸润的标准并在术前基于这些因素选择患者来实现更大的临床意义。在设计研究的离体实验部分时，研究人员非常谨慎地评估了显示可比炎症状态的组织部位。然而，尽管每位患者仅使用1个息肉标本，研究人员观察到同一标本不同横截面之间炎症状态和组织学特征存在相当大的变异性。这种标本内异质性——最显著地见于病例3，其中1个切片显示嗜酸性粒细胞密度显著高于同一息肉的相邻切片——突显了一个重要的方法学考量。虽然3维组织分析的重要性已在其他医学学科中报道，未来鼻息肉研究应同样调查炎症的3维异质性。这可能需要识别明确考虑这种空间变异性的新型预后标志物。在未来研究中，增加患者数量并确定标准化嗜酸性粒细胞计数方法可能产生更稳健的结果。这种方法有潜力减轻嗜酸性粒细胞计数评估缺乏一致性的问题，同时解决组织异质性问题。
结论部分翻译：组织嗜酸性粒细胞计数是CRSwNP诊断、预后和治疗资格的基石，然而本研究表明这些计数易受延迟甲醛固定导致的系统性减少的影响。在临床实践中，鼻息肉标本经常在生理盐水中储存远超推荐的30 min固定窗口。研究人员的离体实验证实，这种延迟在切除后24 h内即产生可测量的、进行性的嗜酸性粒细胞计数减少和上皮完整性下降。鉴于嗜酸性粒细胞阈值在多个国家指导手术决策、复发预测和生物制剂治疗资格，缺乏标准化组织处理方案代表了临床上显著且可纠正的可变性来源。跨机构和地区标准化固定时间和标本处理方案对于确保CRSwNP组织学嗜酸性粒细胞评估的可靠性和可比性至关重要。
