基于EQA的MUC1/CA15-3 harmonisation程序的验证研究

《Tumor Biology》：Verification of a previously obtained EQA based MUC1/CA15-3 harmonisation procedure

　　

目的：MUC1/CA 15-3是晚期乳腺癌患者治疗监测中应用最广泛的循环标志物。既往研究表明MUC1/CA 15-3检测方法的harmonisation（协调化）不足，且已开发出一种基于外部质量评估（EQA）的harmonisation程序。本研究旨在验证已获得的MUC1/CA 15-3 harmonisation程序，并探讨MUC1/CA 15-3材料作为未来MUC1/CA 15-3参考物质开发基础的适用性。方法：获取45例患者的血清样本，并利用商业MUC1/CA 15-3材料制备5份额外样本。所有样本均通过Abbott Alinity、Beckman DxI、Roche Cobas和Siemens Atellica检测程序进行分析。数据分析包括应用既往获得的MUC1/CA 15-3 harmonisation程序（仅需对Beckman DxI进行重新校准）、harmonisation前后Passing-Bablok回归分析、Spearman相关系数分析及Bland-Altman差异分析。同时研究了MUC1/CA 15-3材料作为未来标准品基础的适用性。结果：harmonisation前各MUC1/CA 15-3检测方法回归分析获得的斜率为0.598至1.96，harmonisation后为0.8448至1.150。各检测方法与共识均值（consensus mean）的平均差异从harmonisation前的?26.65%至22.83%改善至harmonisation后的?12.78%至10.95%。MUC1/CA 15-3加标材料与患者样本平均差异之间的差异≤10.1%，且落在95%一致性限（LoA）范围内。结论：基于EQA的MUC1/CA 15-3数学harmonisation程序在真实世界临床样本中改善了MUC1/CA 15-3的harmonisation。MUC1/CA 15-3材料为进一步探索作为参考物质提供了合适的基础。

研究背景：CA 15-3是乳腺癌患者中应用最广泛的循环肿瘤标志物，自Centocor公司最初开发原始CA 15-3检测方法以来，大量研究证明CA 15-3在尤其晚期乳腺癌患者的随访和监测中具有高度价值。CA 15-3是该人群中升高最频繁的肿瘤标志物，其变化与肿瘤负荷的临床变化相关。然而，目前CA 15-3的临床使用及其在临床指南中的提及受到一定限制，主要原因是缺乏证明其临床效用的高级证据，以及缺乏关于如何解读和使用纵向变化进行临床决策的明确指导。CA 15-3肿瘤标志物通过夹心免疫分析方法中与两种单克隆抗体（DF3和115D8）的反应性来定义，其测量对象是一种循环蛋白MUC1，本身是一种高度糖基化的跨膜蛋白。尽管CA 15-3指特定的抗体组合，但多家体外诊断（IVD）供应商使用其他抗体组合提供循环MUC1检测，并以CA 15-3检测的名义在临床上市和使用。为将MUC1识别为CA 15-3的分析物，本文使用MUC1/CA 15-3而非CA 15-3来描述所有以CA 15-3名义销售的检测，但不一定使用原始CA 15-3抗体配置。多种常规肿瘤标志物检测（包括MUC1/CA 15-3）临床使用面临的一个特定挑战是其harmonisation有限，原因是缺乏可交换的、普遍接受的标准品，以及肿瘤标志物临床出现和临床使用检测设计两者的异质性。既往利用全球EQA数据研究了6种常用肿瘤标志物的harmonisation状况，发现MUC1/CA 15-3检测缺乏充分的harmonisation。作为下一步，研究人员进行了计算机模拟分析以研究通过重新校准改善MUC1/CA 15-3 harmonisation状况的潜力，发现重新校准可显著改善MUC1/CA 15-3的harmonisation状况，harmonisation前平均偏倚范围?29.28%至9.86%可降低至harmonisation后?0.09%至0.12%。作为后续研究，本研究首先设计用于验证既往获得的数学MUC1/CA 15-3 harmonisation程序在真实个体患者样本中的性能；第二个次要目的是研究商业可得的纯化MUC1/CA 15-3材料作为开发MUC1/CA 15-3检测程序参考物质基础的适用性。

研究人员开展的研究：研究人员获取了荷兰癌症研究所45例具有MUC1/CA 15-3结果的个体患者剩余血清样本，样本选择覆盖正常和升高的MUC1/CA 15-3水平的相关分析范围。此外获取了低MUC1/CA 15-3结果的血清池用于制备加标样本。研究获得机构审查委员会批准（IRBm24-142），按照赫尔辛基宣言原则进行。获取了两种商业MUC1/CA 15-3材料用于评估作为未来参考物质基础的适用性：从腹水中纯化的CA 15-3（CT3282，Biosynth Group）和由肿瘤细胞系分泌产生的CA 15-3（P301-4，BBI Solutions）。50份样本（45份来自个体患者，5份来自MUC1/CA 15-3材料研究）在Abbott Alinity、Beckman DxI、Roche Cobas Pro和Siemens Atellica检测程序上进行了双份测定。数据分析包括应用既往获得的MUC1/CA 15-3 harmonisation程序（仅需对Beckman检测程序进行数学重新校准：MUC1/CA 15-3recal = [MUC1/CA 15-3 – 3.07]/0.526）、harmonisation前后Passing-Bablok回归分析、Spearman相关系数分析和Bland-Altman差异分析。通过使用四种纳入检测程序的简单均值（称为共识均值）作为参考值，然后对每种检测程序进行Bland-Altman差异分析来计算当前harmonisation状态。harmonisation后MUC1/CA 15-3状态的计算类似，但使用harmonisation后Beckman MUC1/CA 15-3recal值计算共识均值。harmonisation程序的性能与既往基于EQA的研究结果进行比较，基于生物学变异的偏倚最低、期望和最佳质量水平分别为13.9%、9.3%和4.6%。总体MUC1/CA 15-3 harmonisation的改善通过最大平均差异与共识均值的显著降低（95% CI不重叠）来确定。对于MUC1/CA 15-3材料研究，将Biosynth和BBI样本作为单独组绘制在回归分析图和Bland-Altman图中，以了解其行为是否与个体患者样本相似。如果商业材料至少落在EQA样本的95%一致性限内且在与检测程序均值的差异在最低偏倚标准内，则认为适合在IRP开发过程中进行后续研究。

结论及意义：基于EQA的MUC1/CA 15-3数学harmonisation程序在四种真实世界MUC1/CA 15-3检测系统中显著改善了MUC1/CA 15-3的harmonisation，最大系统偏差从共识均值的26.65%改善至12.78%，harmonisation后系统偏差均在基于生物学变异的最低偏倚标准13.9%以内。斜率范围从harmonisation前的0.598至1.96改善至harmonisation后的0.8448至1.150。两种商业MUC1/CA 15-3材料（BBI和Biosynth）与患者样本的平均差异最大相对差异为10.1%，均落在95% LoA内，支持其作为开发MUC1/CA 15-3参考物质基础材料的潜力，为进一步探索作为参考物质提供了合适基础。然而，个体患者样本获得的MUC1/CA 15-3数值结果之间的差异仍然显著，harmonisation后平均差异区间跨度约23-24%，Bland-Altman分析中观察到的CV%范围8.65%至25.82%，显著高于EFLM工作组确定的健康个体内生物学变异4.4%，超出任何基于生物学变异的精密度性能标准。本研究支持开发MUC1/CA 15-3的国际参考制剂（IRP）或国际标准品（IS），但需要对纳入的MUC1/CA 15-3材料作为参考物质开发基础材料进行进一步探索。

关键技术方法：研究纳入荷兰癌症研究所45例个体患者剩余血清样本（覆盖正常及升高MUC1/CA 15-3水平）及5份商业MUC1/CA 15-3材料（Biosynth CT3282腹水纯化CA 15-3和BBI P301-4肿瘤细胞系分泌CA 15-3）加标样本，在Abbott Alinity、Beckman DxI、Roche Cobas Pro和Siemens Atellica四种检测程序上双份测定。数据分析采用Passing-Bablok回归分析、Spearman相关系数分析、Bland-Altman差异分析，并应用既往获得的基于EQA的数学harmonisation程序（仅需Beckman DxI重新校准）。研究经IRBm24-142批准。

研究结果：

MUC1/CA 15-3方法比较研究：收集样本范围9.5至714.5 kU/L（基于Roche结果），包括17份低于推荐正常上限（ULN）35 kU/L的样本和28份高于ULN的样本。双份值观察到的相对差异为Abbott≤8.8%、Beckman≤19.2%、Siemens≤6.6%、Roche≤10.5%，均认为可接受。harmonisation前斜率范围0.598至1.96，harmonisation后0.8448至1.150。harmonisation前斜率估计的95% CI仅Roche vs. Abbott回归分析包含1.0；harmonisation后Beckman vs. Abbott和Roche vs. Beckman的斜率95% CI也包含1.0。harmonisation前平均差异范围?38.95%至51.01%，harmonisation后在13.30%至?22.68%之间。所有相关性≥0.95，使用原始CA 15-3抗体配置的检测程序（Abbott、Siemens和Roche）之间相关性最高，均≥0.987。

MUC1/CA 15-3 harmonisation验证研究：各检测程序与共识均值的平均差异范围从harmonisation前的?26.65%至22.83%改善至harmonisation后的?12.78%至10.95%。harmonisation后三项回归分析中两项的斜率不再显著不同于1.0（Beckman vs. Abbott和Roche vs. Beckman），Siemens vs. Beckman的斜率仍显著不同于1.0。由于harmonisation前后最低和最高平均差异的95% CI不重叠，认为harmonisation改善显著。Beckman的Bland-Altman CV同时从harmonisation前18.60%扩大至harmonisation后25.82%。

MUC1/CA 15-3材料作为未来IRP开发适用性研究：每种方法中两种纯化材料显示相似的回收率，且与纳入研究的患者样本相似。基于Bland-Altman差异分析图，两种商业材料均符合落在LoA内的标准。观察到的最大相对差异为Biosynth材料在Roche检测程序中的10.1%。两种材料尽管来源不同（BBI材料由人癌细胞系产生，Biosynth材料从人体体液中提取），但MUC1/CA 15-3活性与患者样本大致相似，与患者平均差异的最大差异约10%。

讨论部分总结：本研究调查了近期获得的基于EQA的MUC1/CA 15-3数学harmonisation程序在真实世界中的性能，次要目的是评估两种商业MUC1/CA 15-3材料作为未来参考物质基础的可能性。结果表明，从EQA分析得出的harmonisation程序显著改善了纳入的MUC1/CA 15-3检测程序的harmonisation，尽管个体EQA样本的相关差异仍然存在。此外，本研究中评估的两种MUC1/CA 15-3材料的初始数据支持其作为开发MUC1/CA 15-3参考物质基础材料的潜力，应进一步研究其包括互换性在内的特性。尽管原始CA 15-3肿瘤标志物检测方法开发已40年且MUC1/CA 15-3检测在全球临床实践中可用，但研究表明MUC1/CA 15-3检测产生的MUC1/CA 15-3结果在数量上存在显著差异。本研究中观察到的相关性均≥0.95，表明MUC1/CA 15-3检测程序之间具有合理的相关性。研究还发现Roche MUC1/CA 15-3结果高于EQA研究和本研究中其他使用原始CA 15-3抗体配置的检测程序，可能归因于常规临床实践中校准、校准品批次和试剂批次的变异。harmonisation后平均差异区间跨度约23-24%（Siemens ?12.78%和Roche 10.95%）仍然较高，从临床角度是否可接受以允许MUC1/CA 15-3结果的互换性值得商榷。Bland-Altman分析中观察到的CV%均高于10%范围至40%，剩余harmonisation后CV%范围8.65%至25.82%，显著高于EFLM工作组确定的健康个体内生物学变异4.4%，超出任何基于生物学变异的精密度性能标准。Siemens与共识均值的差异因应用harmonisation程序而增加，这是由于参考目标（共识均值）的偏移而非Siemens检测性能的恶化。重新校准扩大了Beckman检测程序的离散度而非抑制它，这可能只是数学起源，因为重新校准后Beckman浓度更高，从而增加了与共识均值的相对差异。进一步harmonisation的关键问题是MUC1/CA 15-3检测程序的harmonisation是否会改善或至少不损害整体临床性能并真正允许使用更通用的临床决策阈值。MUC1/CA 15-3参考物质的开发过去曾讨论过，但由于MUC1蛋白的异质性特征和检测程序之间广泛认可的差异，分析物定义不明确，可行性受到质疑。国际标准ISO 21151和ISO 17511已开发用于允许在没有参考测量程序可用时对检测程序进行harmonisation。本研究不真正验证新开发的IRP或IS，研究设计为初步检查商业MUC1/CA 15-3材料是否适合作为开发IRP或IS材料的基础。当候选参考物质开发时需要进行正式互换性研究。研究结论翻译：本研究证明基于EQA的MUC1/CA 15-3数学harmonisation程序使用四种真实世界MUC1/CA 15-3检测系统改善了MUC1/CA 15-3的harmonisation，并为开发MUC1/CA 15-3的国际参考制剂或国际标准品提供了支持。然而，个体患者样本获得的MUC1/CA 15-3数值结果之间的差异仍然显著。此外，有必要进一步探索纳入的MUC1/CA 15-3材料作为开发MUC1/CA 15-3参考物质基础材料的适用性。