迷迭香与嘉宝果提取物的化学成分、抗氧化及抗生物膜作用及其对人角质形成细胞的细胞毒性研究

《International Microbiology》：Chemical composition, antioxidant and antibiofilm actions of Salvia rosmarinus and Plinia cauliflora extracts against endodontic pathogens and cytotoxicity on human Keratinocytes

　　

由于根管系统内耐药微生物的持续存在，寻找新型根管冲洗液至关重要。本研究评估了迷迭香（Salvia rosmarinus）和嘉宝果（Plinia cauliflora）水醇提取物（HEE）的化学成分、抗氧化活性、协同及抗生物膜作用，针对粪肠球菌（Enterococcus faecalis）临床菌株及牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）和具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）标准菌株，并检测其对永生化人角质形成细胞系（HaCaT）的细胞毒性。制备并过滤提取物后，定量可溶性固形物、黄酮类和酚类含量，随后进行高效液相色谱（HPLC）分析。评估最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC），继而通过棋盘微量稀释法评估自由基抑制（抗氧化）活性和提取物组合的协同活性。分析最有效浓度对生物膜的作用，随后在HaCaT细胞系上检测提取物的细胞毒性。数据采用Kruskal Wallis和Dunn检验分析（p ≤ 0.05）。迷迭香提取物含9.48 mg/mL可溶性固形物，富含咖啡酰奎宁酸和绿原酸。嘉宝果含22.22 mg/mL可溶性固形物，以没食子酸和鞣花酸为主要化合物。两种提取物均表现出抗氧化活性，迷迭香EC₅₀为59 μg/mL，嘉宝果EC₅₀为159 μg/mL。当0.036 mg/mL迷迭香与2.77 mg/mL嘉宝果联合使用时，对粪肠球菌观察到 additive 抗菌效应。两种提取物在低浓度下均未降低HaCaT细胞的代谢活性。

根管系统中的微生物及其副产物是牙髓及根尖周疾病的主要病因。根管治疗的目标是根除这些微生物、其副产物及根管内残留的污染组织。尽管报道的根管治疗成功率可达97%，但当感染控制不足以恢复或维持根尖周组织健康时，治疗失败仍可发生。在治疗失败病例中，微生物通常在根管内形成生物膜，尽管与原发性感染相比多样性较低。粪肠球菌是这些病例中最常鉴定出的菌种之一，主要归因于其耐受恶劣条件的能力。其他菌种如牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌也已被分离，其中粪肠球菌和牙龈卟啉单胞菌在整个再治疗阶段频繁持续存在，凸显其对根管治疗的抵抗力。次氯酸钠（NaOCl）是最广泛使用的根管冲洗液，因其对多种微生物及其副产物的抗菌作用、溶解有机组织的能力以及去除根管内碎屑和坏死组织的有效性。然而，其作用机制——分解有机组织——也导致其与人组织生物相容性低，若挤出根尖孔外则存在细胞毒性和潜在组织损伤的风险。相反，关于草药提取物的研究因其抗菌、抗炎和抗氧化特性以及低细胞和遗传毒性且无微生物耐药性而日益受到认可。多种植物提取物已被评估并证明对多种根管病原体具有潜在抗菌作用。草药组合在特定比例混合时表现出协同药理效应，进一步增强其与蛋白质的相互作用并增强其抗菌作用。迷迭香（Salvia rosmarinus Spenn.）属于唇形科，以其抗菌和抗氧化特性而闻名，常用作调味剂和食品防腐剂。迷迭香已在蜡螟模型中针对白色念珠菌进行测试，因其抗真菌效应和生物相容性而被指示为真菌感染的预防剂。它在减少多微生物生物膜中的金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、变形链球菌或铜绿假单胞菌方面有效，并与氢氧化钙联合作为根管内药物针对粪肠球菌时呈现有希望的结果。此外，它在减少其他口腔细菌如牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌方面也有效。此外，嘉宝果（Plinia cauliflora (Mart.) Kausel）是巴西本土树种，属于桃金娘科。嘉宝果针对口腔细菌的研究较少，但它能有效减少金黄色葡萄球菌（标准菌株）和鲍曼不动杆菌（标准和临床菌株）的生物膜形成。本研究旨在评估迷迭香和嘉宝果水醇提取物（HEE）的化学成分、协同相互作用和抗生物膜活性，针对关键根管病原体——具体为粪肠球菌临床菌株以及牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌标准菌株。此外，评估提取物对自发永生化人角质形成细胞系（HaCaT）的细胞毒性。据研究人员所知，这是首次研究这些草药提取物对根管病原体的协同效应。零假设为所测试的提取物无协同或抗生物膜效应且具有细胞毒性。研究人员开展了以下研究：提取物制备采用浸渍技术，植物材料采自巴西圣若泽杜斯坎普斯当地生产者（坐标：南纬23°10′44″，西经45°53′13″，海拔平均600米），于2023年10月春季采集。将30 g干燥迷迭香叶和30 g嘉宝果果皮分别加入50:50（v/v）乙醇:超纯水混合溶剂中（150 mL超纯水+150 mL无水乙醇），室温恒温振荡提取48 h。浸渍后经两阶段过滤（纸滤去除固体残渣、0.22 μm膜滤除菌），提取物储存于无菌管中冷藏。提取率（%）按公式计算。可溶性固形物含量（SSC）采用重量法测定：5 mL提取物置于已称重烧杯中，60°C烘箱蒸发至恒重，计算可溶性固形物百分比。总黄酮含量采用氯化铝（AlCl₃）比色法测定，以槲皮素当量（QE）表示，标准曲线线性范围5–100 μg/mL（R²=0.998）。总酚含量采用Folin-Ciocalteu法测定，以没食子酸当量（GAE）表示，标准曲线线性范围10–200 μg/mL（R²=0.997）。化学成分采用高效液相色谱-二极管阵列检测（HPLC–DAD）分析，使用Merck-Hitachi D-7000系统，Lichrochart-Lichrospher柱（RP-18，12.5×0.4 cm，5 μm），流动相A为水:甲酸（95:5，V/V），B为甲醇，线性梯度0%–70% B（50 min），流速1 mL/min，进样量20 μL，检测波长320 nm。抗氧化活性采用DPPH自由基抑制法测定，计算EC₅₀（消除50%自由基的浓度）。抗菌活性针对粪肠球菌临床菌株（编号2）、牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277和具核梭杆菌ATCC 25586，采用肉汤微量稀释法（CLSI M7-A6和M11-A7）测定MIC和MBC。协同活性采用棋盘微量稀释法评估，因MIC无法可靠测定，使用MBC值建立浓度范围，计算分数杀菌浓度（FBC）指数。抗生物膜活性：各菌株生物膜在96孔板中单独形成7天（培养基每48 h更换），随后暴露于单独提取物或协同/ additive组合5 min和24 h，采用MTT法评估微生物代谢活性，2.5% NaOCl为阳性对照。细胞毒性：HaCaT细胞（来源：里约热内卢细胞库）培养于DMEM+10% FBS，以2×10⁴细胞/孔接种，暴露于提取物5 min或24 h后MTT法评估细胞活力。统计分析采用Shapiro–Wilk正态性检验，非参数数据采用Kruskal Wallis和Dunn多重比较检验（α ≤ 0.05），GraphPad Prism 10.6.1软件。研究结果如下：可溶性固形物、总黄酮和总酚含量：迷迭香和嘉宝果HEE均为液体提取物，迷迭香呈深绿色，嘉宝果呈红紫色。迷迭香和嘉宝果HEE的可溶性固形物含量分别为9.48和22.22 mg/mL。迷迭香HEE总黄酮含量为1.58 mg QE/mL，嘉宝果HEE未检测到黄酮类。迷迭香和嘉宝果HEE总酚含量分别为7.45 mg GAE/mL和7.29 mg GAE/mL。提取物储存于无菌管中冷藏（4°C）直至进一步分析。提取物化学成分：迷迭香HEE的HPLC–DAD色谱分析显示峰：1-咖啡酰奎宁酸（保留时间"Rt"6 min）、2-没食子鞣质（Rt 11 min）、3-绿原酸（Rt 10 min）、4-对香豆酸（Rt 15 min）和5-醌类（Rt 20 min）。嘉宝果HEE的HPLC–DAD色谱分析显示峰：1-没食子酸（Rt 12 min）、2-对香豆酸（Rt 16 min）、3-肉桂酸衍生物（Rt 19 min）和4-鞣花酸（Rt 20 min）。对香豆酸、绿原酸和咖啡酰奎宁酸（咖啡酸衍生物）采用各自标准曲线定量，咖啡酸用于标准曲线制备（相同UV–Vis光谱不同Rt），没食子鞣质和醌类无标准品。提取物抗氧化活性：迷迭香和嘉宝果HEE的EC₅₀值分别为59.0和159 μg/mL，迷迭香HEE具有最高抗氧化活性。提取物对浮游培养物的抗菌活性：因迷迭香和嘉宝果HEE的强烈着色和频繁沉淀，MIC值无法测定，这些植物提取物的典型特征使处理板视觉读取困难。迷迭香HEE的MBC值范围为0.14至1.18 mg/mL，嘉宝果HEE的MBC值范围为2.77至5.55 mg/mL。提取物组合的协同活性：因MIC值无法测定，未计算分数抑菌浓度（FIC）指数。基于两种HEE的MBC值计算分数杀菌浓度（FMC）指数。0.036 mg/mL迷迭香与2.77 mg/mL嘉宝果组合对粪肠球菌2临床菌株呈现additive结果。然而，迷迭香和嘉宝果HEE组合未观察到additive或协同效应。提取物抗生物膜活性：5 min处理后，1.18 mg/mL迷迭香HEE和2.5% NaOCl分别有效降低粪肠球菌2预形成生物膜代谢活性52%和92%，与对照组及其他测试组有统计学显著差异（P ≤ 0.05）。然而，组合提取物（2.77 mg/mL嘉宝果+0.036 mg/mL迷迭香）的additive FICI未显著降低粪肠球菌2预形成生物膜代谢活性（7%和23%），与对照组（未处理）相比（P > 0.05）。24 h处理后，组合提取物、5.55 mg/mL嘉宝果和1.18 mg/mL迷迭香分别显著降低预形成细菌生物膜代谢活性6%、23%、40%和88%，与对照组有统计学显著差异（P ≤ 0.05）。因未发现对牙龈卟啉单胞菌的协同或additive效应，评估提取物MBC、2×MBC和3×MBC对生物膜的作用。发现迷迭香HEE所有测试浓度5 min后未有效降低预形成生物膜代谢活性，但24 h后有效，与对照组有统计学显著差异（P ≤ 0.05）。相反，嘉宝果HEE所有测试浓度在5 min和24 h后与2.5% NaOCl一样有效降低预形成生物膜代谢活性，与对照组有统计学显著差异（P ≤ 0.05），除3×MBC外。因未发现对具核梭杆菌的协同或additive效应，评估提取物MBC、2×MBC和3×MBC对生物膜的作用。发现所有测试浓度均有效降低具核梭杆菌预形成生物膜代谢活性，与2.5% NaOCl一样有效，与对照组有统计学显著差异（P ≤ 0.05），5 min和24 h后均如此。提取物对人角质形成细胞（HaCaT）的细胞毒性：迷迭香和嘉宝果提取物在MBC水平（分别为0.14至1.18 mg/mL、2.77至5.55 mg/mL）及更高浓度，5 min和24 h暴露后显著降低HaCaT细胞代谢活性（P ≤ 0.05）。然而，嘉宝果提取物在亚MBC（? MBC）浓度，5 min和24 h暴露后未显著降低HaCaT细胞代谢活性（P > 0.05）。讨论部分总结：本研究探讨了迷迭香和嘉宝果单独及组合植物提取物对继发性或持续性根管感染相关微生物的治疗效果，分析了植物化学成分并评估了对人角质形成细胞（HaCaT）培养的细胞毒性，目标是为未来管理持续性感染或失败根管治疗开发替代方案。研究零假设部分被拒绝，仅一种提取物组合呈现additive效应，两种提取物对测试菌株均呈现有效抗菌作用，某些浓度提取物对人角质形成细胞（HaCaT）培养呈现低细胞毒性。研究发现迷迭香和嘉宝果HEE的SSC分别为9.48和22.22 mg/mL，嘉宝果HEE的SSC与文献中另一文章一致。迷迭香和嘉宝果HEE总黄酮含量分别为0.158和0 mg/mL，总酚含量分别为0.754和0.729 mg/mL。另一研究中嘉宝果提取物总酚含量定量为0.115 mg/mL，差异可能源于提取方法和溶剂不同，直接影响提取物最终化学成分。本研究使用水醇溶剂，而另一研究使用乙醇溶剂。本研究的关键方面是选择水醇提取（50:50乙醇:水），可高效提取极性和非极性生物活性化合物。乙醇被公认为生物活性化合物提取的安全溶剂，水增强亲水成分的溶解度。浸渍时间（24 h）选择以在提取所需化合物与保留热不稳定化合物之间取得良好平衡。植物化学谱分析对理解提取物生物活性潜力至关重要。黄酮类和酚类化合物因具有充分记录的抗氧化和抗菌效应而被特别关注。本研究HPLC–DAD色谱谱鉴定迷迭香中植物化学化合物包括咖啡酰奎宁酸、没食子鞣质、绿原酸、对香豆酸和醌类。另一研究检测到迷迭香酸、羟基肉桂酸衍生物、绿原酸和咖啡酸，其他研究中发现其他成分。相反，嘉宝果色谱分析呈现没食子酸、对香豆酸、肉桂酸衍生物和鞣花酸峰，这与先前研究报告鞣花酸和没食子酸等化合物一致。随后，生物学测定提供了对这些化合物功能特性的见解，特别是清除自由基和抑制微生物生长的能力。本研究中迷迭香和嘉宝果HEE的EC₅₀值分别为0.059和0.159 mg/mL，迷迭香HEE具有最高抗氧化活性。该活性在其他研究中也有报道，归因于这些提取物的化学成分，因咖啡酰奎宁酸和对香豆酸具有抗氧化活性。另一研究中迷迭香抗氧化活性报道为0.777 mg/mL（Folin-Ciocalteu比色法测定），而本研究值为0.059 mg/mL，差异可能由不同种植区域解释，气候、土壤和环境条件直接影响植物提取物最终特性。值得注意的是，虽然HEE抗氧化能力通过DPPH法IC₅₀测定评估，但实验设计未包括标准抗氧化化合物如Trolox或抗坏血酸，因此本研究获得的IC₅₀值与已知参考抗氧化剂不直接可比，限制了提取物相对效力的解释。未来研究应纳入标准抗氧化剂以实现比较评估和更全面理解抗氧化活性。原发性、继发性或持续性根管感染相关生物膜包含不同类型细菌。文献强调肠球菌属，特别是粪肠球菌，在继发性或持续性根尖周炎中普遍存在。此外，治疗后感染中频繁发现的其他微生物包括具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌。本研究中NaOCl用作阳性对照组，因其对不同类型根管病原体的有效性。发现2.5% NaOCl有效降低本研究中所有测试菌株的生物膜形成。因植物提取物的颜色和沉淀，MIC值未直接获得。然而，迷迭香HEE的MBC值范围为0.14至1.18 mg/mL，嘉宝果HEE的MBC值范围为2.77至5.55 mg/mL。这些发现表明低浓度提取物使用肉汤微量稀释法有效抑制本研究中所有测试细菌的浮游培养物形成。虽然组合提取物未观察到协同效应，但这并不妨碍其潜在应用，因单独使用时对继发性根管感染相关菌株呈现有希望的抗生物膜活性，且0.036 mg/mL迷迭香与2.77 mg/mL嘉宝果组合对粪肠球菌2呈现additive效应。据研究人员所知，本研究是文献中首次评估这两种提取物协同作用的研究。抗菌分析进一步扩展到生物膜评估，考虑生物膜在临床环境中构成重大挑战，特别是根管感染。本研究中迷迭香提取物对粪肠球菌临床菌株生物膜形成呈现显著减少，1 mg/mL浓度24 h处理期间实现40%减少。对于厌氧菌株，高于浮游培养物有效浓度的单独提取物产生 similarly 令人鼓舞的结果。嘉宝果提取物对具核梭杆菌菌株处理5 min期间导致51%–73%减少，迷迭香提取物减少生物膜形成35%–60%。24 h后，嘉宝果提取物产生31%–42%减少，迷迭香提取物减少生物膜26%–39%。对于牙龈卟啉单胞菌菌株，嘉宝果提取物5 min内有效降低微生物活力31%–41%。24 h迷迭香提取物处理显示牙龈卟啉单胞菌菌株微生物活力降低22%–57%。文献中迷迭香提取物针对龋齿细菌包括变形链球菌、唾液链球菌、远缘链球菌、轻链球菌、血链球菌和粪肠球菌测试，具有有效抗菌活性。此外，针对原位初始口腔生物膜测试，减少口腔厌氧细菌生物膜形成，推荐其作为合成物质的草药佐剂用于生物膜控制。嘉宝果同样有效，针对金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌生物膜测试，具有有效抗生物膜作用。观察到较高浓度迷迭香提取物5 min后似乎促进具核梭杆菌生物膜形成，可能反映毒物兴奋效应，低剂量抑制细菌活性但高剂量引起适应性甚至刺激效应。这种双相行为已有报道对于多种植物来源化合物，可能由于亚致死应激诱导，细菌增加生物膜产生作为防御机制。另一种可能性是某些植物化学物质在较高浓度可能作为营养底物或信号调节剂，无意中增强生物膜基质产生。此外，迷迭香HEE单独优于组合的观察挑战了协同假设，可能反映化学拮抗、生物利用度降低或植物成分间相互作用。虽然组合通常被假设因植物化学多样性而增强活性，但并非总是如此。本研究结果表明在此特定配方中，组合未导致协同增强甚至可能降低抗氧化潜力。未来研究使用CI或FIC计算以及植物化学谱分析对阐明这种相互作用性质是必要的。除检查植物提取物治疗效果外，评估其生物相容性对开发可整合既定治疗方案的制剂至关重要。本研究纳入细胞毒性测定以评估提取物安全性特征，此步骤对确定其在预期人体使用制剂中的潜在应用至关重要。Lorenzo-Leal等（2019）体外研究发现迷迭香精油对人巨噬细胞有细胞毒性，降低细胞活力。相反，体内研究证明该精油治疗糖尿病大鼠增强伤口愈合，在蜡螟模型中生物相容，仅引起6.6%幼虫死亡率。本研究中虽然提取物显示与2.5% NaOCl处理对照组相当的细胞毒性，但细胞活力降低相对较低，表明更好的细胞耐受性。然而研究的关键限制是方法学缺乏统一性，可能影响细胞毒性结果解释。尽管如此，这支持草药应用的可行性，考虑次氯酸钠虽具细胞毒性但在根管治疗方案中被广泛使用和接受。值得注意的是，细胞毒性测定中使用DMEM+10% FBS作为阴性对照以维持最佳细胞活力，虽然较低血清浓度（如2% FBS）可能更好控制增殖，这被认为是方法学限制。未进行细胞形态学显微镜评估，研究人员承认这是限制，因 such 评估提供关于早期细胞毒性反应的有价值定性数据。本研究有几个限制在解释发现时应考虑。首先提取物抗菌和抗生物膜活性在体外条件下评估，不完全重现根管系统复杂环境，包括牙本质相互作用、有机组织残留和成熟多微生物生物膜结构复杂性。此外因提取物强烈着色和沉淀，MIC值无法可靠测定，因此使用MBC值指导组合效应评估。生物膜反应和细胞毒性评估依赖MTT测定，测量代谢活性而非直接量化生物膜根除或HaCaT活力。最后未研究重复或亚抑菌暴露后细菌敏感性降低的潜在发展，也未直接检查观察到的抗菌和抗生物膜效应机制。通过整合这些不同分析方法，研究旨在提供提取物治疗潜力的全面表征。本研究结果有希望，特别是因使用低浓度已证明抗生物膜功效。未来研究应纳入验证的中和和 carry-over 对照、提取物特异性测定空白、补充微生物学方法如活菌落计数、更临床相关的牙本质和成熟生物膜模型、根管组织相关的额外细胞类型以及重复暴露方案。提取物化学表征和机制研究也必要。因此目前发现应视为初步体外证据，在得出这些提取物在根管治疗中临床适用性或安全性结论前需进一步研究。结论翻译：迷迭香和嘉宝果HEE在所研究的体外条件下表现出抗氧化活性、组合时对粪肠球菌的additive效应（0.036 mg/mL迷迭香和2.77 mg/mL嘉宝果）以及单独使用时对粪肠球菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌生物膜的抗菌作用。两种提取物在低浓度下均未显著降低人角质形成细胞代谢活性。虽然迷迭香通常表现出更强抗菌活性，这些发现应解释为初步体外证据。需要进一步研究使用感染牙本质和根管模型、成熟生物膜、补充微生物学方法和更全面生物相容性评估以确定其在根管治疗中的潜在应用。