肽而非维生素：酵母提取物中支撑耐盐嗜酸菌Sulfobacillus thermosulfidooxidans葡萄糖呼吸的组分

《World Journal of Microbiology and Biotechnology》：Peptides, not vitamins: Yeast extract components sustaining glucose respiration of the halotolerant acidophile Sulfobacillus thermosulfidooxidans

　　

在盐性条件下利用Sulfobacillus thermosulfidooxidans DSM 9293^T进行硫化矿生物浸出受到氯离子诱导胁迫的限制，尽管该物种本身具有一定的耐盐性。酵母提取物（YE）补充可改善氯离子耐受性，但其组成不明确阻碍了工艺标准化。为解决这一问题，研究人员在不额外添加NaCl的测定条件下，系统研究了酵母提取物中哪些组分对支撑Sulfobacillus thermosulfidooxidans的呼吸作用至关重要，旨在以组成更简单的培养基补充物替代YE。比较评估证实，Sulfobacillus thermosulfidooxidans在受试Sulfobacillus物种中耐盐性最强，可耐受高达500 mM NaCl（约17.7 g Cl^? l^?1）并维持Fe(II)氧化活性。呼吸测定表明，酪蛋白氨基酸（CA）、葡萄糖和钾可支撑显著的呼吸活性，并在第7天达到与YE相当的终点，尽管起始延迟，而单独维生素效果甚微。进一步缺失实验鉴定出谷氨酸族、天冬氨酸族、组氨酸以及丙氨酸/支链氨基酸族为呼吸作用的重要贡献者。分子量分级显示，YE中0.5至1 kDa之间的组分主要刺激呼吸作用。另外，对CA来源物质的FT-ICR-MS分析鉴定出118个与二肽或三肽组成兼容的独特元素分子式，其中26个相对于未接种对照表现出培养相关的消失。尽管高分辨率FT-ICR-MS可提供准确的元素组成，但缺乏碎片数据无法区分同分异构肽序列或共享相同分子式的同量异位残基。因此，这些归属被解释为候选肽组成而非序列解析的肽。总之，这些发现表明CA、葡萄糖和钾可维持葡萄糖依赖性呼吸至与YE相当的终点，尽管呼吸激活较慢。然而CA仍化学组成复杂，因此代表一种组成更简单而非完全明确的补充策略。该补充在氯离子胁迫下是否提供相当的支持仍有待直接验证。

**研究背景**

生物湿法冶金利用铁氧化和硫氧化细菌从低品位硫化矿中回收金属，在特定条件下是传统火法冶金工艺的环境可持续且经济上具有吸引力的替代方案。在工业规模运营中，生物浸出可能面临循环浸出液中氯离子积累的挑战，尤其是在蒸发浓缩盐分的系统中，或依赖咸水/海水进行加工的地区。因此，近年来对在升高的氯离子浓度下进行生物浸出过程的兴趣日益增长，已知氯离子可通过破坏钝化层和促进矿物溶解来提高黄铜矿浸出效率。然而，高氯离子水平对微生物群落施加显著的生理胁迫，包括渗透胁迫、氧化胁迫和酸胁迫。在酸性条件下，氯离子在一定程度上可透过细胞膜，可瓦解嗜酸细菌的质子动力势，导致能量保存丧失和细胞质内pH稳态的破坏，这些条件不利于细胞存活和代谢活性。这种敏感性限制了嗜酸铁氧化和硫氧化菌在盐性条件下的有效性，并需要开发在不损害生物氧化活性的前提下增强微生物耐盐性的策略。

Sulfobacillus thermosulfidooxidans是一种革兰氏阳性、中等嗜热、混合营养型嗜酸菌，已证明能够在酸性条件下氧化亚铁和还原态无机硫化合物，使其适用于槽浸和堆浸中的生物浸出应用。先前研究已揭示Sb. thermosulfidooxidans中存在潜在应对NaCl浓度升高的基因，并报道了其耐受NaCl浓度高达500 mM的能力，取决于先前适应、生长底物和培养基组成。先前对嗜酸细菌的研究表明，氯离子对铁氧化的抑制强于硫氧化。然而，这一方面尚未针对Sb. thermosulfidooxidans等中等嗜热混合营养菌进行系统研究。尽管Sb. thermosulfidooxidans相比许多其他嗜酸铁氧化菌表现出更高的氯离子耐受性，但支持这种耐盐性的代谢途径和营养需求的详细研究仍然有限。

酵母提取物（YE）是一种复杂的营养补充物，已被证明可增强Sb. thermosulfidooxidans在盐性条件下的活性和氯离子耐受性。然而，其化学组成复杂且批次依赖性强的特点使机制解释复杂化，并可能限制实验间和实验室间的可重复性。YE含有广泛的肽、氨基酸、维生素、核苷酸和无机成分，这些成分可能对细胞代谢有不同的贡献。然而，其中哪些成分负责支持Sb. thermosulfidooxidans的呼吸作用仍不清楚。因此，鉴定这些成分将为开发组成更简单的补充策略以及区分一般营养需求和氯离子胁迫特异性诱导的响应提供基础。

为解决这些问题，本研究有两个互补目标。第一，比较几种Sulfobacillus物种间的氯离子耐受性，以确定Sb. thermosulfidooxidans DSM 9293^T在Sulfobacillus属内的相对氯离子耐受性。第二，在不额外添加NaCl的测定条件下研究支持Sb. thermosulfidooxidans葡萄糖依赖性呼吸的营养成分，特别关注氨基酸、钾、维生素、YE低分子量组分和酪蛋白氨基酸中存在的化合物。

**关键技术方法**

研究人员采用改良Mackintosh（1978）培养基（初始pH 1.8）培养五种Sulfobacillus模式菌株（来自DSMZ），通过视觉评估铁氧化（培养基颜色从淡绿色变为橙棕色）确定氯离子耐受性阈值。使用基于传感器点的密封血清瓶氧气饱和监测系统（OxygenLogger软件）评估呼吸活性，以归一化O₂饱和度剩余百分比作为呼吸活性代理指标。通过超滤（3 kDa和1 kDa截留分子量）和纳滤（500 Da截留分子量）对YE和CA进行分子量分级。采用ESI-FT-ICR-MS（电喷雾电离傅里叶变换离子回旋共振质谱）结合ENV⁺固相萃取分析CA来源低分子量化合物，并通过计算机模拟生成所有可能的二肽和三肽组合文库进行分子式匹配筛选。

**研究结果**

**氯离子耐受性测定**：通过比较五种Sulfobacillus模式菌株的氯离子耐受性，发现Sb. thermosulfidooxidans DSM 9293^T耐受性最高，生物Fe(II)氧化在高达500 mM NaCl（约17.7 g Cl^? l^?1）下仍可检测到。最低耐受性为Sb. acidophilus DSM 10332^T，仅50 mM NaCl（1.77 g Cl^? l^?）。Sb. sibiricus DSM 17363^T为75 mM（2.66 g Cl^? l^?1），Sb. harzensis DSM 109850^T为125 mM（4.43 g Cl^? l^?1），Sb. benefaciens DSM 19468^T为175 mM（6.20 g Cl^? l^?1）。

**CA、维生素和钾联合对呼吸活性的影响评估**：通过7天 incubation 的呼吸测定，发现补充组成强烈影响Sb. thermosulfidooxidans的呼吸响应。双倍浓度CA和维生素（含或不含额外钾）处理下，第7天剩余O₂饱和度降至约13%，而YE对照约为26%。单独维生素几乎不产生可检测的呼吸刺激，O₂饱和度全程接近100%。较低浓度CA处理显示中间响应，第7天剩余O₂饱和度约55–63%。含CA补充持续支持显著的葡萄糖依赖性呼吸，而单独维生素效果甚微。

**氨基酸需求评估**：通过缺失实验，发现完整氨基酸混合物（AA）仅支持有限的呼吸活性，第7天剩余O₂饱和度约89%，而YE引起更大幅度的O₂饱和度下降，第7天约68%。去除谷氨酸族、丙氨酸/支链氨基酸族、组氨酸或天冬氨酸族后，氧消耗相对于完整AA混合物显著降低，第7天保持约94–100%初始O₂饱和度，接近未接种化学对照（约97%）。相反，去除丝氨酸族或芳香族氨基酸导致比完整AA混合物更大的氧消耗，第7天剩余O₂饱和度分别约82%和78%。CA+K处理与YE相比显示不同的时间响应：YE在最初几天促进更快速的O₂饱和度下降，而CA+K响应延迟，但第7天CA+K达到约62%剩余O₂饱和度，YE约68%，表明尽管起始较慢，CA+K在测定结束时支持与YE相当甚至略强的氧消耗。

**YE分子量分级**：通过超滤和纳滤分级，发现<500 Da YE渗透物仅产生有限的O₂饱和度下降（第7天约89%剩余），而>500 Da富集截留物支持显著更大的氧消耗（第7天约74–75%剩余），与未分级YE（约76%）相当。通过1 kDa膜的滤液也保持强呼吸刺激活性（第7天约74–75%剩余）。<3 kDa组分显示中间响应（第7天约80%剩余）。表明YE呼吸刺激活性的相当部分与保留在500 Da截留值以上同时足够小以通过1 kDa膜的化合物相关，活性物质富集在约0.5–1 kDa分子量范围内。

**CA超滤分级**：通过超滤分级，发现CA分级显著降低其支持呼吸的能力。未分级CA第7天剩余O₂饱和度约48%，而<1 kDa和<3 kDa CA组分分别保持约62%和65%。<1 kDa和<3 kDa组分产生相似的呼吸响应，表明进一步将渗透物从<3 kDa限制到<1 kDa未显著改变其呼吸支持能力，但两者均不如未分级CA有效。表明CA的完整呼吸效应不能仅归因于1或3 kDa以下的化合物，可能依赖额外的高分子量成分和/或未分级水解物中多种组分间的相互作用。

**FT-ICR-MS表征CA来源化合物的培养相关变化**：通过ESI-FT-ICR-MS分析，发现培养基中存在化学多样性的低分子量化合物池。ESI(?)模式下分子式广泛分布于脂质类、肽/蛋白质类、氨基糖类、碳水化合物类、木质素类和缩合烃类区域。ESI(+)模式下检测的分子式主要集中在肽/蛋白质类、脂质类、氨基糖类和缩合烃类区域。针对计算机模拟二肽和三肽文库筛选，在ESI(?)模式下t0检测到44个肽兼容分子式，t7检测到56个，两个时间点共65个不同分子式。ESI(+)模式下t0检测到101个，t7检测到61个，共109个不同分子式。总计在接种培养物中检测到118个与二肽或三肽组成兼容的独特元素分子式。其中107个在t0检测到，82个在t7检测到，11个仅在t7检测到，36个仅在t0检测到，71个在两个时间点均检测到。在t0检测到的肽兼容信号中，57个模式特异性信号在7天后不再在接种培养物中检测到。与未接种化学对照比较，其中28个信号（代表26个独特分子式）在对照中t0和t7均保持可检测，被归类为培养相关消失。两个分子式C₉H₁₈N₂O₄和C₁₆H₂₇N₃O₆在两种电离模式下均显示培养相关消失。C₉H₁₈N₂O₄与二肽组成Ser/Ile、Ser/Leu或Val/Thr兼容，C₁₆H₂₇N₃O₆与三肽组成Ile/Glu/Pro或Leu/Glu/Pro兼容。由于元素分子式和精确质量不能解析残基顺序或结构异构体，这些信号未归属到个别肽序列。

**讨论与结论**

本研究旨在系统评估几种Sulfobacillus物种间的氯离子耐受性，鉴定可能适用于盐性条件下生物浸出的菌株，并阐明支持耐盐Sb. thermosulfidooxidans代谢的分子因素。五种Sulfobacillus模式菌株氯离子耐受性的比较评估清楚表明该属内存在显著的生理多样性，特别是在酸性条件下承受渗透和离子胁迫的能力方面。在所测试物种中，Sb. thermosulfidooxidans表现出显著的耐盐性，在NaCl浓度高达500 mM（约17.7 g Cl^? l^?1）下维持亚铁氧化活性，这一发现与先前报道其在长时间暴露于盐性条件下持续活性的研究一致，并支持其在海水基生物浸出系统中应用的可行性。然而，比较氯离子耐受性值应被解释为条件特异性的而非绝对的物种特异性最大值。由于比较测定在45 °C下进行四种菌株、37 °C下进行Sb. benefaciens，表观氯离子耐受阈值可能部分反映测定温度而非仅内在物种特异性耐受性。

为系统研究Sb. thermosulfidooxidans的营养需求，研究人员采用光学氧传感器系统监测低pH下的呼吸活性。在葡萄糖基培养基中进行的初始实验表明，Sb. thermosulfidooxidans的呼吸活性对有机和无机添加剂高度响应，表明在测试条件下维持代谢活性强烈依赖外部营养补充。添加CA（含或不含伴随维生素混合物）持续增强氧消耗，而单独维生素混合物无效果，显然不是代谢刺激的主要驱动因素。这与Alicyclobacillus sp. SO9的发现形成对比，其中硫胺素和烟酸被证明对活性至关重要。尽管 apparently 缺乏维生素依赖性，Sb. thermosulfidooxidans的营养需求仍然复杂，目前无法建立完全明确的最小培养基即为证据。此外，双倍浓度CA导致呼吸活性进一步增强，证明明显的剂量依赖性响应。与CA相比，钾补充的效果较不一致且取决于具体实验条件。总体而言，钾对呼吸的影响不如CA显著和多变。然而，钾可能有助于嗜酸微生物中的离子平衡和细胞内pH稳态。但由于本研究的营养解剖实验未添加NaCl，无法得出钾在氯离子胁迫期间支持呼吸的具体作用的结论。

为进一步剖析该生物的氨基酸依赖性，在葡萄糖基、无铁条件下进行了系统缺失实验。去除谷氨酸族、天冬氨酸族、组氨酸或丙氨酸加支链氨基酸族强烈降低氧消耗，最终O₂饱和度值接近非生物对照。这些发现表明属于这些氨基酸组的化合物在测试条件下对呼吸响应有实质性贡献。然而，缺失实验未确立生长的绝对需求，因为测量的是呼吸活性而非生物量形成或培养物增殖。有趣的是，完整氨基酸混合物（17种氨基酸，排除天冬酰胺、谷氨酰胺和色氨酸因其预期水解）仅引起非常低的氧消耗（约89%归一化O₂饱和度剩余），而YE持续诱导显著更高的呼吸活性（约68%剩余）。这种模式表明游离氨基酸混合物可能不提供Sb. thermosulfidooxidans有效摄取和代谢所需的最佳组成或生物利用度。YE或CA优越性能的一种可能解释在于肽结合氨基酸比游离氨基酸更有效的利用，如在Lactobacillus casei中所示，肽被证明比其组成氨基酸支持更有效的生长，可能由于更有效的摄取和利用。这一解释也与Sb. thermosulfidooxidans可用的基因组信息兼容。菌株ST的比较基因组分析鉴定了几种氨基酸和寡肽/二肽转运系统以及亮氨酰和甲硫氨酰氨肽酶，为肽结合氨基酸的摄取和细胞内加工提供了潜在的分子基础。然而，这些系统的存在并不证明在本文所检条件下个别肽的优先利用。

为探究呼吸支持组分的分子大小分布，对YE和CA进行了膜分级。对于YE，<500 Da渗透物仅支持有限呼吸，而>500 Da富集截留物和<1 kDa组分保持与未分级YE相当的活性。这些结果表明YE呼吸支持活性的相当部分与约0.5–1 kDa标称分子量范围内的化合物相关。然而，该范围不应被解释为特定化合物类别的证据，特别是因为膜MWCO值代表操作性而非绝对分子大小边界。CA显示不同的分级模式。未分级CA比<1 kDa或<3 kDa组分支持更大的氧消耗，表明低分子量组分 alone 不足以再现水解物的完整效应。这可能反映来自更高分子量成分的贡献、分级过程中的损失或几种CA组分间的相互作用。重要的是，YE分级和FT-ICR-MS分析应独立解释：0.5–1 kDa活性窗口是使用YE确定的，而后续质谱肽筛选是在CA来源物质上进行的。因此，FT-ICR-MS检测的肽兼容分子式不能假定解释0.5–1 kDa YE组分的活性。YE的其他低分子量成分，包括核苷酸来源化合物或辅因子，也可能有贡献，值得未来研究。

鉴于CA、葡萄糖和钾支持的呼吸活性，研究人员评估了这种组成更简单的补充是否能再现YE获得的呼吸响应。尽管氧消耗起始相对于YE延迟，但CA+葡萄糖+钾处理在第7天达到相似终点。因此，在本呼吸测定的限度内，YE可在最终呼吸响应方面被功能性替代，尽管呼吸激活发生更慢。然而CA仍是化学复杂的酪蛋白水解物，可能因制造商和生产批次而异。因此其使用降低了相对于YE的组成复杂性，但不构成完全明确的培养基。真正明确的配方需要鉴定和实验测试负责观察到的呼吸支持的个别化合物。本研究未进行技术经济评估，CA在此不被提议为经济上更优的工业YE替代品。相反，其在本背景下的价值在于降低组成复杂性并促进支持呼吸的营养因素的实验鉴定。

对CA来源培养样品的FT-ICR-MS分析为低分子量化合物的化学多样性提供了额外证据，这些化合物可能与肽组成兼容。针对修订的计算机模拟文库筛选，在两种电离模式和时间点共鉴定出118个与二肽或三肽组成兼容的独特元素分子式。然而，元素分子式和精确质量不能解析氨基酸序列顺序或结构异构体，这些信号因此代表候选肽组成而非鉴定的肽序列。时间比较进一步显示，一部分肽兼容信号在 incubation 期间从接种培养物中消失。与未接种化学对照比较后，28个电离模式特异性信号（代表26个独特分子式）显示培养相关消失。这种培养相关消失与相应化合物的微生物利用或转化一致，尽管其确切生化命运无法从本分析中解析。尽管如此，Sb. thermosulfidooxidans菌株ST基因组中报道的寡肽/二肽转运系统和氨肽酶的存在为该物种成员利用肽结合氨基酸提供了合理的生理基础。

对Alicyclobacillus sp. SO9和Sb. thermosulfidooxidans关于营养需求和培养液中代谢物的ESI-FT-ICR-MS分析揭示了与高氯离子条件下生物浸出应用相关的关键差异。Alicyclobacillus sp. SO9表现出生长对NaCl的专性需求并依赖维生素补充（硫胺素和烟酸）以及天冬氨酸族特定氨基酸（Asp、Met、Thr、Lys）来维持代谢活性。尽管补充维生素混合物和酪蛋白氨基酸，完全替代YE尚未实现，表明存在对该菌株生长和活性必需的其他未鉴定的低分子量（<1 kDa）化合物。相比之下，Sb. thermosulfidooxidans DSM 9293^T表现出高达500 mM NaCl的耐盐性但不需要盐 for 生长，提供操作灵活性。该菌株未显示对测试维生素补充的明显需求，在本文所检无额外NaCl条件下，CA、葡萄糖和钾支持显著的葡萄糖依赖性呼吸。与YE相比，呼吸响应显示延迟起始但在第7天达到相似终点。因此，CA、葡萄糖和钾可支持与YE获得的相当的呼吸终点。CA来源培养样品的FT-ICR-MS分析鉴定出众多与候选二肽和三肽组成兼容的分子式，包括26个独特分子式相对于未接种对照显示培养相关消失。这种模式与相应化合物的微生物利用或转化一致，尽管个别氨基酸的优先利用无法从本文数据中解析。然而CA仍化学复杂，因此代表一种组成更简单而非完全明确的补充策略。

Alicyclobacillus sp. SO9和Sb. thermosulfidooxidans的比较分析阐明了这些嗜酸铁氧化菌维持生物浸出活性所采用的多样策略。这些发现拓宽了对氯离子需求/氯离子耐受铁氧化细菌间营养需求和代谢可塑性的理解，从而为开发与盐性生物浸出系统相关的氯离子耐受微生物的组成更简单培养策略的进一步努力提供了概念基础。