体外血凝块机械性能与纤维蛋白原及白细胞亚型的关联：兼论血细胞比容和性别的影响

《Annals of Biomedical Engineering》：In Vitro Blood Clot Mechanical Properties are Associated with Fibrinogen and White Blood Cell Subtypes in Addition to Hematocrit and Sex

　　

目的 理解血液成分在血凝块力学中的作用可能为其诊断和治疗提供关键线索。为此，研究人员此前表明性别和标准血液成分指标可解释血凝块力学性能的某些变异，但仍有大量变异未得到解释。研究人员及其他团队的研究在很大程度上忽略了纤维蛋白原和白细胞（white blood cell, WBC）亚型的作用，这鉴于其生理重要性而言是令人惊讶的。为了更深入地理解什么影响血凝块的力学性能，研究人员现在在性别和标准血液成分指标之外，还研究了纤维蛋白原水平和白细胞（WBC）亚型的作用。

方法 研究人员从健康的年轻成年人抽取血液，并制备体外凝块样本。使用纯剪切（pure shear）和I型断裂（mode-I fracture）测试，研究人员测量了凝块的刚度（stiffness）、断裂韧性（fracture toughness）、强度（strength）和断裂功（work to rupture）。随后，研究人员使用线性回归（linear regression）评估血液成分与凝块力学性能之间的关联，并报告决定系数（coefficient of determination）R²以描述这些关联的强度。

结果 纤维蛋白原表现出与凝块力学性能最强的关联，与全部四项指标呈正相关，并取得最高的平均R²。例如，纤维蛋白原与70%的刚度变异和78%的断裂韧性变异相关。在白细胞亚型中，中性粒细胞（neutrophils）与强度和断裂功呈正相关，而嗜酸性粒细胞（eosinophils）与强度呈负相关。

结论 研究人员的工作确定了纤维蛋白原水平和白细胞（WBC）亚型与体外凝块力学性能之间存在强关联，而这些关联在全血中在很大程度上尚未被探索。未来研究应将上述发现与体内（in vivo）凝块行为和临床结局相联系。

血凝块机械性能在生理功能及血栓栓塞性疾病发展中起关键作用，影响栓塞风险、血管嵌顿位置及对溶栓和机械取栓等治疗的反应。由于体内凝块无法被直接获取，体外凝块成为广泛使用的研究模型，既往研究表明患者体外凝块的结构能够在一定程度上反映其体内凝块行为与血栓风险。然而，现有研究仍存在明显不足：研究人员前期工作虽证实性别对19至46岁人群的体外凝块力学性能具有显著影响，且标准血液成分指标亦产生中度效应，但血细胞比容（hematocrit）这一传统主要驱动因素却未能解释大部分观察到的力学变异性；白细胞计数（white blood cell, WBC）虽被提示可影响凝块力学性能，但缺乏分类计数数据，难以明确具体亚型的作用机制。此外，纤维蛋白原（fibrinogen）与WBC亚型在血液凝块力学中的生理作用长期被忽视，尽管二者在生理层面至关重要。因此，缩小年龄范围至健康的20岁出头人群以减少与血液成分无关的变异，并在标准完整血细胞计数（complete blood count, CBC）基础上纳入纤维蛋白原与WBC分类计数，成为深入解析血液成分对凝块力学性能影响的必要路径。

为明确哪些血液成分与体外凝块机械性能的变异性相关，研究人员招募了6名健康女性（22–25岁）与6名健康男性（20–27岁），采集静脉血后制备体外凝块，并在纯剪切（pure shear）与I型断裂（mode-I fracture）两种几何构型下测定凝块的刚度（stiffness）、断裂韧性（fracture toughness）、强度（strength）及断裂功（work to rupture）。通过线性回归与多元模型分析，研究人员发现凝块力学性能与性别、血细胞比容、纤维蛋白原及特定白细胞亚型密切相关。该研究首次在健康受试者中揭示了生理范围内纤维蛋白原与单个白细胞亚型对全血凝块机械性能的显著影响，深化了对凝块异质性生物学基础的认识，为理解血液成分如何关联血栓栓塞风险及治疗反应提供了新的理论依据。

样本队列为6名健康女性（22–25岁）与6名健康男性（20–27岁），经The University of Texas at Austin机构审查委员会（Institutional Review Board, IRB）批准后采集静脉血。血液分别采集于酸柠檬葡萄糖（acid citrate dextrose, ACD）、dipotassium ethylenediaminetetraacetic acid（K₂EDTA）及trisodium citrate管，后者送临床实验室进行完整血细胞计数（complete blood count, CBC）分类及纤维蛋白原检测。凝块制备时加入10% (w/v)氯化钙（calcium chloride）逆转抗凝并启动凝血，浇筑于Velcro衬里的3D打印模具（40 × 10 × 3 mm），覆以胶带后于37°C孵育60分钟，每名受试者每种测试模式设3个技术重复。机械测试在单轴拉伸试验机（Instron）上以0.2 mm/s位移速率进行，载荷传感器精度为±0.02 N，图像采集频率5 Hz。刚度定义为拉伸比1.35处的切线模量，强度为峰值应力，断裂功为破坏前总能量；断裂韧性Γ_c依据I型测试中裂纹扩展起始拉伸比λ_c，结合纯剪切样本在λ_c处的应变能密度W(λ_c)与样本高度H（10 mm）按Γ_c = W(λ_c)H计算。此外，通过离心重悬技术构建0%、10%、20%、60%、80%及天然血细胞比容样本，通过添加冻干人纤维蛋白原使浓度较基线提升0–400 mg/dL，并设置凝血酶（thrombin）激活组与单纯氯化钙凝固组，以解析单一成分的独立贡献。统计分析采用R（Version 4.3.2），运用Student's t检验、Pearson相关分析、Benjamini-Hochberg校正、嵌套F检验及线性混合模型（linear mixed model）。

血液成分因性别而异
研究人员通过对比男女血液检测数据发现，男性的血细胞比容（47.97 ± 2.74 vs. 40.03 ± 3.75 %, p = 0.019）、红细胞（red blood cell, RBC）计数（5.32 ± 0.15 vs. 4.38 ± 0.37 M/uL, p = 0.002）及血红蛋白（hemoglobin）（16.02 ± 0.83 vs. 13.18 ± 1.42 g/dL, p = 0.019）均显著高于女性。而血小板计数、纤维蛋白原水平、白细胞总数及各白细胞亚型（包括中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞及未成熟粒细胞）在性别间均无显著差异。

血凝块机械性能在男性和女性受试者之间差异
通过纯剪切与I型断裂测试，研究人员发现男性来源凝块的刚度（4.78 ± 0.43 vs. 6.28 ± 0.91 kPa, p = 0.013）和断裂韧性（1.46 ± 0.08 vs. 2.19 ± 0.33 J/m², p = 0.001）显著低于女性来源凝块；但两性在强度（2.82 ± 0.49 vs. 3.89 ± 0.94 kPa, p = 0.064）与断裂功（0.55 ± 0.12 vs. 0.82 ± 0.23 kJ/m³, p = 0.064）上未呈现统计学差异。

血凝块机械性能与多种血液成分指标相关
通过Pearson相关分析与线性回归，研究人员发现血细胞比容与刚度（R² = 0.72, p = 0.006）、断裂韧性（R² = 0.63, p = 0.01）、强度（R² = 0.59, p = 0.014）及断裂功（R² = 0.52, p = 0.023）均呈显著负相关。纤维蛋白原与全部四项指标呈正相关，且关联强度最高，与刚度（R² = 0.70, p = 0.006）、断裂韧性（R² = 0.78, p = 0.006）、强度（R² = 0.64, p = 0.01）及断裂功（R² = 0.50, p = 0.03）均显著相关。白细胞亚型中，中性粒细胞与强度（R² = 0.54, p = 0.02）和断裂功（R² = 0.55, p = 0.019）呈中度正相关；嗜酸性粒细胞与强度（R² = 0.45, p = 0.043）呈弱负相关。多元模型进一步显示，在控制性别后，纤维蛋白原对刚度和断裂韧性仍具有显著附加解释力，而血细胞比容仅在刚度上表现出性别之外的额外关联。

血凝块机械性能与超出生理范围的血细胞比容和纤维蛋白原相关
通过线性混合模型分析，研究人员发现当血细胞比容在0%至80%范围内变化时，其与刚度（边际R² = 0.75, p < 0.001）、断裂韧性（边际R² = 0.62, p < 0.001）、强度（边际R² = 0.63, p < 0.001）及断裂功（边际R² = 0.57, p < 0.001）均显著相关。当纤维蛋白原浓度较基线增加0至400 mg/dL时，其与刚度（边际R² = 0.91, p < 0.001）、断裂韧性（边际R² = 0.86, p < 0.001）、强度（边际R² = 0.90, p < 0.001）及断裂功（边际R² = 0.89, p < 0.001）亦呈强相关。凝血酶激活实验则未发现加与不加凝血酶条件下凝块机械性能存在显著差异。

讨论部分总结
研究指出，凝块机械性能与性别、红细胞相关指标、纤维蛋白原及特定白细胞亚型（中性粒细胞与嗜酸性粒细胞）密切相关，而与血小板计数及其他白细胞亚型无显著关联。在机制层面，中性粒细胞可能通过形成中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps, NETs）在结构层面增强纤维蛋白网络，从而与强度及断裂功呈正相关；嗜酸性粒细胞则可能通过释放毒性颗粒蛋白干扰细胞外基质架构，对凝块强度产生负面影响，但该机制在本研究体系中尚未直接验证。对于纤维蛋白原，其在生理及扩展范围内均与凝块力学性能强相关，提示即使健康个体中，纤维蛋白原亦是决定凝块异质性的关键因素。同时，研究人员承认体外凝块模型存在局限：其为均质、富红细胞、无流动且缺乏老化血栓胶原沉积的简化体系，最能代表新鲜静脉凝块；此外，研究未直接测量血小板激活及其向凝块中的整合情况，样本量亦相对有限，且未考虑激素周期等性别特异性因素。

研究结论
总之，研究人员发现凝块机械性能与性别、红细胞指标、纤维蛋白原水平以及特定白细胞亚型（包括中性粒细胞和嗜酸性粒细胞）强相关。据研究人员所知，这是首项证明在健康受试者中，生理变异性的纤维蛋白原和单个白细胞亚型与全血凝块机械性能相关的研究。这些发现扩展了研究人员对导致凝块异质性的生物学因素的理解，并为血液成分如何可能影响血栓栓塞风险和治疗反应提供了新的见解。未来的工作应旨在将体外凝块机械性能与血栓栓塞性疾病的临床结局直接关联，以更好地理解其生理学及病理学意义。