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脑疾病是全球范围内致残的主要原因之一，构成重大公共卫生挑战。神经发育障碍（NDDs）和神经退行性疾病（NDs）影响数百万人，造成显著的社会负担。尽管这些疾病通常具有强的遗传因素，环境因素可显著影响疾病风险和严重程度。尤其值得关注的是环境化学物质对不良神经发育结
脑疾病是全球范围内致残的主要原因之一，构成重大公共卫生挑战。神经发育障碍（NDDs）和神经退行性疾病（NDs）影响数百万人，造成显著的社会负担。尽管这些疾病通常具有强的遗传因素，环境因素可显著影响疾病风险和严重程度。尤其值得关注的是环境化学物质对不良神经发育结局和其他神经系统疾病的贡献日益引发担忧（Grandjean and Landrigan 2014）。尽管经过数十年的使用，动物模型往往无法预测人类结局，原因在于种间差异及体内试验固有的其他局限性，导致NDDs的转化价值有限且对临床结局的预测效度不佳，造成中枢神经系统药物开发的高失败率。发育神经毒性（DNT）化学物质的监管评估同样依赖动物试验，尽管其对人类的预测能力有限（Paparella et al. 2020）。因此，迫切需要与人相关的新方法学（NAMs）用于化学品安全性评估。在DNT背景下，这促成了DNT体外测试组合（DNT-IVB）的开发，该组合由个体NAMs组成，评估化学物质对被认为与DNT危害评估相关的八个关键神经发育过程的影响（Blum et al. 2023; OECD 2023），符合欧洲委员会逐步淘汰化学品安全性评估中动物试验的路线图（EC 2026）。简单的体外系统无法捕捉脑生理学和细胞相互作用的复杂性，尤其是髓鞘形成所需的条件——髓鞘形成是一个高度协调的过程，依赖于多种神经细胞类型之间的相互作用。这促成了复杂3D脑模型的发展，使更接近生理的细胞相互作用成为可能。该领域已逐步从基于啮齿动物的模型转向人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的系统，用于疾病建模、神经毒性测试、药物发现和个性化医疗（Lancaster et al. 2013; Pamies et al. 2017）。若干研究已报道这些模型中的体外髓鞘形成（Lange et al. 2025; Pamies et al. 2017），但真正的髓鞘形成仍有待确证。髓鞘形成是少突胶质细胞和施旺细胞将其细胞延伸物反复以同心层包裹轴突的过程，形成髓鞘绝缘轴突并实现动作电位的快速跳跃传导。在人类中，髓鞘形成始于出生前，持续贯穿儿童期、青春期和成年早期。在发育过程中，少突胶质前体细胞（OPCs）通过受周围细胞环境（包括神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞）相互作用影响的严格调控过程分化和成熟为髓鞘化少突胶质细胞（Yal??n and Monje 2021）。主要髓鞘相关蛋白，包括髓鞘碱性蛋白（MBP）、蛋白脂质蛋白1（PLP1）、髓鞘相关糖蛋白（MAG）和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG），被广泛用作少突胶质细胞成熟和髓鞘形成的标志物。髓鞘形成的漫长发育轨迹创造了一个延长的易感窗口，使其易受环境损伤（包括化学物质、应激和创伤）的影响。髓鞘发育和维持的破坏已被认为与NDDs、NDs及若干白质疾病相关（Khelfaoui et al. 2024）。因此，推进髓鞘相关疾病的药物开发和筛选化学物质对髓鞘形成的潜在干扰，需要能够稳健重现髓鞘形成的NAMs。尽管在人3D脑培养中髓鞘形成的报道日益增多，建立真正的髓鞘形成仍然困难。本文讨论了体外鉴定髓鞘的挑战，并提出了评估支持髓鞘形成主张的证据强度的框架。迄今为止，已在若干体外系统中报道了类似髓鞘的结构，包括胚胎干细胞来源的共培养、大鼠视网膜神经节细胞-少突胶质前体细胞共培养和3D人iPSC来源培养（James et al. 2021; Lange et al. 2025; Madhavan et al. 2018; Marton et al. 2019; Pamies et al. 2017; Romero et al. 2022; Shaker et al. 2021）。然而，该领域的一个关键挑战是，此类结构常被称为"髓鞘"而缺乏充分的超微结构或功能验证。将MBP检测误读为髓鞘形成的确定性证据进一步加剧了这一问题。虽然MBP免疫阳性证实成熟少突胶质细胞的存在，但并不能验证轴突包裹。PLP1免疫检测的解读也具有挑战性，因为大多数抗体识别其亚型DM20，该亚型也存在于OPCs中（Timsit et al. 1995）。因此，免疫染色和Western印迹等髓鞘相关蛋白技术仅提供髓鞘形成的间接证据。此外，不一致的术语可能模糊髓鞘样结构与真正髓鞘之间的区分，因为最初描述为"髓鞘样"的结构有时随后被称为"髓鞘"而缺乏支持该解释的额外证据。3D脑模型中支持髓鞘形成的证据往往不足。作者经常展示同心暗结构的电子显微镜（EM）图像，将其解释为髓鞘，尽管支持证据有限。这些培养物的EM分析通常仅限于捕获髓鞘样同心环的选定视野，而未提供其频率、空间分布或整体范围的信息。3D培养中脑细胞类型鉴定的固有挑战加剧了这一局限性，因为3D培养缺乏体内组织中的结构和架构组织，如血管系统和空间取向。此外，无论组织程度如何，轴突和少突胶质细胞的3D排列应产生纵向、横向和斜向取向的髓鞘轮廓。然而，已发表的EM图像主要显示同心轮廓，而横向和斜向视图很少呈现。此外，富含膜的细胞内结构如多板层体（Lajoie et al. 2005）在电子显微照片中可表现为同心板层轮廓，进一步复杂化二维切片中孤立膜涡旋的解释。没有体积电子显微镜（vEM）分析或3D重建提供的结构背景，从单张EM图像得出的结论仍易受解释偏倚的影响。虽然在设计用于支持少突胶质细胞分化的3D培养中可容易地证明少突胶质细胞的存在，但其髓鞘化轴突的能力仍存在关键问题。例如，EM中所见的同心膜结构是否真正对应于髓鞘？同样，髓鞘和轴突标志物的共定位是否能可靠地证明轴突包裹？如何在体外系统中可靠地区分畸形与真正的脱髓鞘？脱髓鞘或髓鞘再生的主张需要稳健的验证，因为并非所有非典型髓鞘结构都反映病理。在正常发育过程中，短暂的错误靶向和不适当的包裹事件发生，随后通过小胶质细胞修剪进行精修（Santos and Fields 2021）。缺乏支持的主张可能歪曲这些模型的功能和结构成熟度。解决这些问题需要认识到EM仍是髓鞘和其他细胞结构高分辨率可视化的金标准，远超光学显微镜的能力。虽然当前评估工具如髓鞘蛋白免疫染色可确认髓鞘成分的存在，但无法解析详细结构或轴突-髓鞘关系。基于荧光的读数可作为髓鞘形成的实用替代指标，但仅在通过超微结构分析确立其与髓鞘形成的关系之后。不幸的是，对于大多数体外系统，采用多种互补分析方法的综合表征仍然有限。此外，对髓鞘形成的时间和结构进展的详细研究仍然有限。鉴于这些局限性，3D脑培养研究领域必须优先进行更全面的EM分析，以正确验证髓鞘形成的主张。拼接透射电子显微镜（TEM）成像结合立体学等方法可评估同心结构（潜在髓鞘）在更大样本区域的分布，而连续切片TEM可解决关于其真实性质的歧义。先进的vEM方法，如Serial Block-Face和Array Tomography（AT）扫描EM，能够实现脑球体/类器官的3D超微结构映射，允许详细检查细胞结构及其组织。重要的是，三维超微结构方法提供了无法从孤立EM切片获得的结构背景。通过揭示连续切片中膜轮廓的连续性和组织，这些方法可确定结构是否形成预期的髓鞘样伸长轴突相关鞘，还是对应于孤立的、不连续的或球形的富膜结构。这凸显了评估推定髓鞘样结构时3D结构背景的重要性。免疫电子显微镜，如Tokuyasu免疫标记（Tokuyasu 1978），是在超微结构水平确认蛋白质存在的最有效技术之一。使用金颗粒连接抗体，可精确局部化髓鞘特异性蛋白，有助于解决其他技术留下的歧义。尽管在其他领域广泛使用，据研究人员所知，免疫金标记尚未应用于脑3D培养。此外，AT结合关联荧光成像提供了在三维背景中整合超微结构和免疫细胞化学数据的强大方法。总体而言，这些方法可显著加强3D脑培养中髓鞘形成的证据。当鉴定出成熟髓鞘形成的标志性特征（如旁结）时，置信水平可进一步提高（James et al. 2021）。连续EM切片的三维重建很少用于检查髓鞘样结构，据研究人员所知，仅在啮齿动物来源系统中报道过（Kerman et al. 2015）。尽管EM需要大量专业知识和资源，且不太可能作为常规高通量筛选终点，但其独特的分辨率使其在模型表征、测试方法建立和定期基准测试中提供髓鞘形成证据方面不可或缺。重要的是，还需要超微结构分析来确定可扩展读数（如髓鞘蛋白免疫染色、报告系统、脂质谱分析、转录组学以及轴突和髓鞘标志物的共定位）是否准确反映髓鞘完整性的变化。建立这些关系对于在明确界定的适用域内自信地解释和应用此类替代终点至关重要。如果不建立这些关系，研究风险在于依赖对脑3D培养发育、毒理学机制、疾病过程和治疗的推测性解释。因此，表1呈现了评估体外髓鞘形成的证据层级。该层级旨在指导髓鞘形成终点的解释，而非定义正式的验证标准。这可能通过促进对基础证据的透明解释来支持髓鞘相关终点的监管使用。本展望强调了区分少突胶质细胞成熟证据与髓鞘形成证据的必要性，并强调严格的超微结构验证和精确科学传播的重要性，以避免对体外发现的过度解释。髓鞘形成、脱髓鞘或髓鞘再生的主张应有适当的证据支持。未来的进展将取决于建立髓鞘形成评估的共识标准和验证可扩展的替代终点与稳健的超微结构证据。若干关键挑战仍未解决。在建立此类关系之前，髓鞘形成的主张应根据支持证据的强度进行解释。本文提出的层级为评估此类主张提供了实用框架，并可能提高人3D脑模型的严谨性、可重复性、可信度和转化价值。
脑疾病构成全球重大公共卫生挑战，神经发育障碍（NDDs）和神经退行性疾病（NDs）影响数百万人。动物模型因种间差异对NDDs转化价值有限，中枢神经系统药物开发失败率高。发育神经毒性（DNT）化学物质的监管评估同样依赖预测能力有限的动物试验，迫切需要与人相关的新方法学（NAMs）。简单体外系统无法捕捉脑生理复杂性，尤其是依赖多种神经细胞类型相互作用的髓鞘形成过程，这促成了人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的3D脑模型的发展。若干研究报道了这些模型中的体外髓鞘形成，但真正的髓鞘形成仍有待确证。髓鞘形成是少突胶质细胞和施旺细胞将细胞延伸物以同心层反复包裹轴突的过程。主要髓鞘相关蛋白包括髓鞘碱性蛋白（MBP）、蛋白脂质蛋白1（PLP1）、髓鞘相关糖蛋白（MAG）和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG），广泛用作少突胶质细胞成熟和髓鞘形成的标志物。髓鞘形成的漫长发育轨迹创造了延长的易感窗口，其破坏与NDDs、NDs及白质疾病相关。因此，推进药物开发和化学物质筛选需要能稳健重现髓鞘形成的NAMs。尽管人3D脑培养中髓鞘形成报道日益增多，建立真正的髓鞘形成仍然困难。本文讨论体外鉴定髓鞘的挑战，并提出评估支持髓鞘形成主张的证据强度的框架。研究结果方面：在体外鉴定髓鞘的挑战部分，研究人员指出已在多种体外系统中报道类似髓鞘的结构，但常缺乏充分的超微结构或功能验证；MBP免疫阳性仅证实成熟少突胶质细胞存在而非轴突包裹；PLP1抗体多识别也存在于OPCs中的DM20亚型；免疫染色和Western印迹仅提供间接证据；术语不一致模糊了髓鞘样结构与真正髓鞘的区分。在3D脑模型中支持髓鞘形成的证据往往不足部分，作者经常展示同心暗结构的EM图像并解释为髓鞘，但分析常限于选定视野，缺乏频率、空间分布或整体范围信息；3D培养缺乏体内组织结构使细胞类型鉴定困难；已发表EM图像主要显示同心轮廓而少有横向和斜向视图；多板层体等富膜结构可表现为同心板层轮廓；无vEM或3D重建的结构背景，单张EM图像的结论易受解释偏倚影响。关于少突胶质细胞髓鞘化轴突能力的关键问题包括同心膜结构是否真正对应髓鞘、共定位是否能可靠证明轴突包裹、如何区分畸形与真正脱髓鞘，以及脱髓鞘或髓鞘再生主张需稳健验证。EM仍是高分辨率可视化金标准，荧光读数仅在超微结构分析确立其与髓鞘形成关系后方可作为替代指标。在前行路径部分，作者提出应优先进行更全面的EM分析，包括拼接TEM结合立体学、连续切片TEM、Serial Block-Face和Array Tomography扫描EM等vEM方法实现3D超微结构映射；免疫电子显微镜如Tokuyasu免疫标记可精确局部化髓鞘特异性蛋白；AT结合关联荧光成像可整合超微结构和免疫细胞化学数据；鉴定旁结等成熟髓鞘形成标志性特征可提高置信水平；EM在模型表征、测试方法建立和定期基准测试中不可或缺；需超微结构分析确定可扩展读数是否准确反映髓鞘完整性变化；并提出体外髓鞘形成评估的证据层级（表1）以指导终点解释。讨论部分总结：本展望强调区分少突胶质细胞成熟证据与髓鞘形成证据的必要性，强调严格超微结构验证和精确科学传播以避免过度解释；髓鞘形成、脱髓鞘或髓鞘再生主张应有适当证据支持；未来进展取决于建立髓鞘形成评估共识标准和验证可扩展替代终点与稳健超微结构证据；在建立此类关系前，髓鞘形成主张应根据支持证据强度解释；提出的层级为评估此类主张提供实用框架，可能提高人3D脑模型的严谨性、可重复性、可信度和转化价值。研究结论译为：本展望强调了区分少突胶质细胞成熟证据与髓鞘形成证据的必要性，并强调严格的超微结构验证和精确的科学传播以避免对体外发现的过度解释。髓鞘形成、脱髓鞘或髓鞘再生的主张应由适当的证据支持。未来的进展将取决于建立髓鞘形成评估的共识标准，并验证可扩展的替代终点与稳健的超微结构证据。若干关键挑战仍未解决。在建立此类关系之前，髓鞘形成的主张应根据支持证据的强度进行解释。本文提出的层级为评估此类主张提供了实用框架，并可能提高人3D脑模型的严谨性、可重复性、可信度和转化价值。
