《Brain Structure and Function》：Complex 3D cytoarchitecture of the anterior horn of the human sacral spinal cord revealed by light sheet fluorescence microscopy
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本研究对人类骶段脊髓前角（S2节段）的细胞构筑进行了独特的三维表征。该区域因构成支配下肢肌肉的运动神经元（MNs）与支配盆底肌肉的运动神经元之间的过渡带而备受关注。S2节段还包含一个独特的运动核——Onuf核（ON），参与括约肌控制。研究人员采用组织透明化方案
本研究对人类骶段脊髓前角（S2节段）的细胞构筑进行了独特的三维表征。该区域因构成支配下肢肌肉的运动神经元（MNs）与支配盆底肌肉的运动神经元之间的过渡带而备受关注。S2节段还包含一个独特的运动核——Onuf核（ON），参与括约肌控制。研究人员采用组织透明化方案结合光片荧光显微术（LSFM），分析了10具人类尸体的骶段脊髓样本，以获得高分辨率三维图像。分割结果揭示了7个不同的运动神经元群，围绕ON组织为内侧部和外侧部。ON本身呈现复杂的多叶结构，中央区域较致密，两端较碎片化。沿ON吻尾轴识别出特定神经元柱的稳健细胞构筑模式，其特征为神经元柱的逐渐消失、融合或出现。值得注意的是，外侧柱在ON吻侧半水平占优势，而内侧柱更偏尾侧出现。此外，观察到ON长度存在显著的性别二态性，男性较长。总体而言，研究结果证明，脊髓运动神经元组织的经典柱状模型低估了前角的结构复杂性。本研究凸显了光片荧光显微术在揭示精细解剖组织方面的价值，并为未来脊髓（SC）细胞构筑研究提供了框架。
研究背景与问题
脊髓（SC）前角包含α、β、γ运动神经元（MNs）以及复杂的中间神经元网络，MNs按肌肉拓扑模式纵向排列成柱。这一细胞构筑在动物与人类中已被广泛研究，并在脊椎动物物种间呈现广泛相似特征。然而，多数解剖教科书与图谱仅以每节段一个切面来描绘人类脊髓内部结构，已有研究提示若干节段存在显著的节内变化，这些变化在经典解剖学表述中未被体现。此类节内变异多见于颈区（C3-C4-C7-T1），而位于支配下肢最尾侧MNs与盆底MNs过渡区的第二骶节段（S2）同样被报道含有显著的节内细微差异。S2还包含Onuf核（ON）——一组支配肛门外括约肌、尿道外括约肌及坐骨海绵体肌、球海绵体肌的较小MNs，以及脊髓副交感核（SPN）的吻侧部。尽管已有大量努力改进对前角细胞构筑的认识，但由组织学切片构建三维重建仍费时且易产生图像失真；主流研究依赖叠加切片绘制MN柱图谱。近年来发展的组织透明化方法结合光片荧光显微术（LSFM）为神经组织的定性与定量三维研究提供了有效工具，但该技术极少用于完整或损伤脊髓成像，用于人类脊髓样本的研究亦极少。基于此，研究人员采用新近发展的透明化与染色方法，选择含ON的人类S2节段进行描述，因ON已知的位置、结构与有限长度提供了合适且易识别的标志，并以ON作为内部标志建立缩放方法以更好描述其周围神经元环境。
研究开展与结论
研究人员提取并制备了10例人类骶段脊髓，获得包含ON的前角三维图像，观察到此前未描述的结构特征及神经元亚群间的空间关系，并识别出个体间可重复的排列模式；同时基于既往主要以动物为对象的研究，为每个神经元群赋予推测功能。研究结论表明，人类骶段前角细胞构筑比既往描述的经典柱状组织更为复杂；通过组织透明化结合LSFM，研究人员提供了难以用常规组织学技术领会的运动神经元群空间关系的直接三维视野；以ON作为内部解剖标志，建立了沿吻尾轴表征可重复模式的框架；揭示了ON长度的性别二态性（男性较长）；并强调特定脊髓区域尤其是S2等过渡节段不能以单一横切面充分代表。三维成像因此提供了脊髓内部组织更可靠的表示，为未来建立完整人类脊髓解剖图谱提供了有价值框架。
关键技术方法
研究使用10具欧洲尸体（5男，死亡年龄76至100岁），均经认证生物样本库（BB 190,051）自愿捐献并生前书面知情同意，样本未行预先防腐处理，取含5个骶段的约3 cm锥形末端样本，4%福尔马林固定至少72 h。核心技术为：按MASH（Multiscale Architectonic Staining of Human cortex）方法进行组织透明化（脱水、漂白、再水化、透化、二次漂白、冲洗、亚甲蓝（MB）染色7天、脱水、脱脂、清洗、折射率匹配液ECi孵育）；以LSFM（UltraMicroscope II，640 nm激光，1.25×物镜加CDC 2×，等距体素2.42 μm）采集图像，BigStitcher-ImageJ拼接，左右侧分别分析共20个样本；以Imaris 10.2.0的Surface creation功能进行人工分割重建神经元柱；以ON首末神经元设定0与1水平及0.5中点作为内部标志定义缩放距离；统计采用t检验（显著性p<0.05），GraphPad-Prism 9先以Shapiro-Wilk检验正态性。
研究结果
Onuf核（ON）：在10例受试者（20个样本）前角双侧均被识别，因密度更高、神经元更小（20至40 μm）而区别于周围神经元柱，呈复杂结构，更宜描述为小簇的堆叠而非连续结构，尤以两端为著，中央区通常连续性更强。
长度：女性ON长度为4.24至6.56 mm（均值5.14±0.76 mm），男性为3.66至8.37 mm（均值6.42±1.41 mm），显著高于女性（p<0.05）；左右侧间无显著差异。
其他神经元柱：分割显示沿ON排列的6个 distinct 神经元柱，部分病例在ON尾侧另见一组；各柱按前角内位置命名并分为外侧部与内侧部。外侧部神经元较大，平均约100 μm，有时更大，形成宽大易识别的柱；内侧部柱较细，神经元略小（60至80 μm）。外侧部包括：前外侧柱（ALC，最前，近白质，横切面呈椭圆形，尾端多突然终止）、中央外侧柱（CLC，位于ALC后方、ON后外侧，随相邻柱与之融合而增宽，形成大的椭圆柱，越向尾侧越偏外且变细）、外侧外侧柱（LLC，外侧部最外侧，与CLC向尾侧逐渐靠近并融合为单一群，致其尾端难以界定）、后外侧柱（PLC，极细，不连续，似神经元簇堆叠，两端难以精确识别，逐渐以少量散在神经元消失）、后后外侧柱（RPLC，整个神经元群中最靠后，与ON同为系统且完整出现于研究区域者，横切面椭圆，呈长而界限清晰的雪茄形，吻端细、尾侧增宽至中段最大径后变细并多突然终止）。内侧部含2个群：前内侧柱（AMC，位于灰质前内侧缘、ON紧内侧，细纺锤形，由神经元簇堆叠呈不连续外观，神经元略小于外侧部但大于中间神经元，横切面为小的常中断的圆形群）与后内侧柱（可见时为最尾侧神经元群，见于20个样本中的11例，AMC后方，吻端由少量散在神经元起始，向尾侧渐宽渐密，其尾端未能观察到）。
沿ON纵轴的细胞构筑序列：尽管距离很短（最大8.4 mm），细胞构筑自水平0至1发生多种变化，虽非所有样本完全一致，但呈现重复模式：水平0时ON为最内侧群，内侧部柱均未出现，5个外侧柱存在且多位于ON后外侧，唯ALC位于前外侧；水平0.5时ON稍向前外侧移位，ALC消失，LLC与CLC融合而不可辨，PLC与RPLC仍见于前角后外侧区；水平1时ON继续前外侧移位，AMC出现，PLC与RPLC仍存在。因此，ON吻侧半高度的两个主要特征为ALC消失及LLC与CLC融合为CLC轴上的单一柱；ON尾侧半高度的主要特征为CLC消失，仅余AMC、PLC、RPLC三柱围绕ON。此外还观察到若干偏离该一般模式的变异：水平0时仅见4个外侧柱，因PLC尚不能与RPLC区分（20例中6例），其在水平0稍下方才自RPLC分离；水平0.5时AMC已可见（20例中8例）；水平1时PLC因尾侧界限更偏吻侧而不可辨（20例中5例），此时ON尾端仅见AMC与RPLC。少数病例存在无法纳入模式的单次特征，包括ALC较短而止于ON吻侧、RPLC较短而止于ON尾端稍上方、PMC较长而始于ON末端水平；1例未见任何内侧部柱，另1例PLC无法清晰识别。
讨论与结论
讨论指出，研究人员将最初为人类大脑皮层大样本开发的组织透明化方法改编应用于脊髓，获得10例受试者前角三维图像，旨在准确描述特定区域内的细胞构筑并证明其虽短却呈现众多拓扑与形态变化。研究描述了沿吻尾轴外侧群逐渐消失、内侧两群出现的重复神经元序列，为理解该区域结构复杂性及下肢与盆底支配的精确过渡提供了新框架。人类神经元排列研究以Nissl染色法为金标准，小分子染料标记神经元核与粗面内质网（Nissl体）；脊髓MNs绝大多数为α-MNs，直径可达120 μm，γ-MNs直径20至30 μm，β-MNs直径居中且数量较少，故本研究所描述的纵向核团可合理认为由α、β、γ MNs组成。既往研究报道ON神经元平均直径26或38 μm，与γ、β-MNs大小相近；中间神经元直径不超过25 μm。本研究方法虽不能区分α、β、γ与ON细胞，但所用MB可将其与更小的中间神经元及胶质细胞区分。选择S2区域的原因包括样本尺寸限制、ON作为内部标志的适用性，以及S2为节内变化最大且含SPN吻侧部的最丰富神经环境之一。本研究测得的ON长度（3.66至8.37 mm）与既往报道的4至7 mm或3.5至7.9 mm相符；既往研究因样本量小未凸显性别二态性，而本研究发现男女间显著长度差异，与动物研究中雄性体积与神经元数量更大的报道一致，可能与雄性生殖肌体积较大有关，但缩放距离未能描绘男女在0–1轴细胞构筑序列上的差异。观察结果与既往ON形态描述总体一致，但本分析揭示其结构更复杂、更碎片化：多数情况下存在中央连续区及两端大量小簇，而非仅吻侧或吻尾侧副核；既往报道的腹外侧与背内侧分部在本样本中不明显，因该分隔主要依赖组织学切片上有髓纤维的可视化，而本研究未标记白质束。研究还确认了ON向尾侧在前角内逐渐前移。三维可视化还使研究人员得以识别常规组织学方法难以描述的复杂形态体，如PLC、AMC与ON内紧密聚集的小群神经元构成的独立簇样、不连续外观，以及RPLC沿纵轴的密度差异，这些特征提示或需重新考虑沿用逾一世纪的"柱"概念，或"梭形"或"纺锤形核"更为恰当。研究亦尝试为每个柱对应既往最全面人类研究中的命名，并参照Sharrard的脊髓灰质炎运动神经元分布图及动物研究，为每个MN核团提出推测功能，同时指出在人类尚无法获得正式证据。与Routal和Pal的报道一致，C3、C4、C7、T1等节段亦表现较大节内变异，而C5、C6、L1、L2、L3等节段MN组织一致、可由单一截面代表，这证实多数解剖教科书与图谱对MN空间排列的描绘并不准确，特定脊髓节段或部位应以多个切面描述。本研究应视为初步工作，为整个人类脊髓细胞构筑的进一步研究铺路；尽管骶区被认为尺寸最小且最一致，其他节段如含膈神经与副神经MNs的C3-C4、位于上肢与躯干支配过渡及交感节前神经元出现的T1-T2亦值得类似关注。未来定量研究应使用LSFM确认并扩展对ON总体积、精确形态、神经元数量与大小及与周围结构连接的认识；改进样本透明化流程与更特异的标记将有助于精细神经元识别；将人工分割方法与自动化机器学习方法比较亦是值得探索的方向。
结论部分译文：本研究表明，人类骶段前角的细胞构筑比既往描述的经典柱状组织更为复杂。通过将组织透明化与光片荧光显微术相结合，研究人员提供了运动神经元群之间空间关系的直接三维视野，而这些关系难以用常规组织学技术领会。此外，以Onuf核作为内部解剖标志，使研究人员得以提供一个可重复的框架，用以表征沿吻尾轴的可重复模式，尽管存在个体间变异。这一可靠的描述凸显了Onuf核长度的性别二态性，即男性较长，正如其他物种所提示的那样，并增进了对周围运动神经元群空间关系的理解。更广泛而言，研究结果强调，特定脊髓区域，尤其是S2等过渡节段，不能像解剖图谱中仍普遍描绘的那样以单一横切面充分代表。因此，三维成像提供了脊髓内部组织更可靠的表示，并为未来旨在建立完整人类脊髓解剖图谱的研究提供了有价值的框架。
