4'-硫代-2'-脱氧胞苷（TdCyd）在晚期实体瘤患者中的Ⅰ期临床研究：安全性、药效学与药代动力学评估

《Cancer Chemotherapy and Pharmacology》：A phase 1 study of 4’-thio-2’-deoxycytidine in patients with solid tumors

　　

目的：DNA甲基转移酶（DNMT）抑制剂4'-硫代-2'-脱氧胞苷（TdCyd）作为第二代胞苷类似物，在临床前研究中显示出强效抗肿瘤活性及良好药代动力学特征，本研究旨在探索其在实体瘤患者中的安全性、疗效及抗肿瘤活性。 方法：晚期实体瘤成年患者于21天为一周期的第1–5天及第8–12天口服TdCyd。剂量递增按照Simon加速滴定设计中的设计4进行，出现剂量限制性毒性（DLT）时转为3+3剂量递增设计。采集血样用于循环肿瘤细胞（CTC）中p16再表达的检测（作为TdCyd表观遗传调控作用的标志物）及药代动力学分析。 结果：共入组27例患者，未达到最大耐受剂量（MTD）。最佳疗效为疾病稳定（SD）延长，3例患者治疗≥6个周期，且无剂量-反应关系。在可评估p16反应的21例患者中，71%（15/21）检测到表达p16的细胞角蛋白阳性（CK+）CTC比例升高，且在所有可评估药效学反应的患者所在剂量水平均可见；波形蛋白阳性（V+）CTC中p16再表达见于38%（6/16）可评估患者。TdCyd代谢物血浆水平基本呈剂量比例关系，且在研究药物相关不良事件发生率及严重程度更高的患者中检测到更高水平。 结论：较低TdCyd剂量水平下出现的SD延长及p16再表达提示，未来试验值得探索低浓度长时间暴露方案，包括TdCyd联合治疗研究。

研究背景：肿瘤抑制基因调控序列CpG位点胞嘧啶高甲基化是肿瘤发生中基因失活的重要表观遗传机制，该甲基化模式由DNA甲基转移酶（DNMT）建立，其中含量最丰富的是维持性甲基转移酶DNMT1。美国食品药品监督管理局（FDA）批准的DNMT抑制剂5-氮杂胞苷和5-氮杂-2'-脱氧胞苷在骨髓增生异常综合征及血液系统恶性肿瘤中有效，但在实体瘤中疗效有限。核苷类似物通过掺入DNA替代胞嘧啶、与DNMT1活性位点结合形成共价复合物并诱导蛋白酶体降解，从而逆转高甲基化；但DNMT1耗竭剂需2代以上肿瘤细胞生长才能重新激活肿瘤抑制基因表达，因此需要延长治疗周期，而这受该类药物的造血毒性限制。这些局限促使研究人员开发治疗指数更优、血浆半衰期更长、对包括实体瘤在内的多种恶性肿瘤效率更高的第二代低甲基化药物。TdCyd是将脱氧核糖4'-O替换为硫的第二代胞苷类似物，对多种癌细胞系具有生长抑制及细胞毒活性，并在体内外证实可耗竭DNMT1；其为脱氧胞苷激酶的良好底物，可磷酸化为4'-硫代-胞苷三磷酸（TdCTP）并掺入DNA，掺入速率与天然核苷或ara类似物相似，可抑制细菌C5 DNA甲基转移酶MHhaI所致的DNA甲基化而不抑制DNA复制。TdCyd经脱氨生成4'-硫代-2'-脱氧尿苷（TdUrd），后者是胸苷激酶和胸苷磷酸化酶的不良底物，从而限制其转化为4'-硫代脱氧胸苷（TdThd）。裸鼠药代动力学研究证实TdCyd血浆清除迅速（10–15 min），TdUrd为主要血浆代谢物（半衰期约45 min）。p16、p15等肿瘤抑制基因启动子甲基化沉默在人类上皮性及血液系统恶性肿瘤中常见，体外实验证实4'-硫代脱氧胞苷类似物可逆转p15和p16沉默；近期在晚期实体瘤患者中亦证实第二代DNMT抑制剂5-氟-2'-脱氧胞苷（FdCyd）可使CTC及肿瘤中p16再表达。比较研究提示硫修饰类似物保留经典药物的表观遗传重编程效力，同时降低全身毒性尤其是限制FDA批准DNMT抑制剂临床应用的骨髓毒性，这构成研究人员在临床环境中探索此类类似物的依据。基于此，研究人员报告了这项在晚期实体瘤患者中探索TdCyd安全性、耐受性及初步抗肿瘤疗效的Ⅰ期研究结果。

研究内容与结论：该研究（NCT02423057）在美国国立卫生研究院（NIH）临床中心开展，2015年5月至2019年1月共入组27例经重度既往治疗的晚期实体瘤患者。主要目标为确定口服TdCyd的安全性、耐受性及最大耐受剂量（MTD）；次要目标包括初步疗效证据、TdCyd对CTC中甲基化沉默基因再表达的影响及口服药代动力学。研究未达到MTD，最高测试剂量为20 mg，因行政原因提前终止。最佳疗效为SD延长（可评估23例中10例，43.5%），3例SD≥6周期，无剂量-反应关系；6 mg与10 mg剂量水平耐受性最佳，>14 mg剂量血液学毒性发生率更高。研究期间出现1例DLT（6 mg组1例腺样囊性癌患者第1周期3级转氨酶升高），2例非HIV感染患者发生耶氏肺孢子菌肺炎（PJP），促使方案修订加入PJP预防并延长DLT评估期，后因预防相关不良事件移除预防。药效学方面，71.4%可评估患者在CK⁺CTC中p16再表达，包括全部3例持久SD患者，且在所有可评估剂量水平（含0.5、2、3 mg最低剂量）均可见；V⁺CTC中p16再表达为37.5%，明显低于CK⁺CTC；p16再表达与肿瘤缩小程度无相关性，剂量调整似不影响药效学反应。药代动力学方面，TdCyd血浆水平在多数样本中低于定量下限（LOQ），快速代谢使消除半衰期无法计算；TdUrd为主要循环代谢物，约给药后60 min达峰（约1 μM），消除半衰期为7.2 h，基本呈剂量比例；TdThd在≥10 mg剂量时超过LOQ，亦基本呈剂量比例，且在不良事件更多更重的患者中水平更高；尿液中仅回收TdUrd，未检出TdCyd。研究结论为：较低TdCyd剂量水平下的SD延长及p16再表达提示，未来试验值得探索低浓度长时间暴露，包括TdCyd联合治疗研究。

关键技术方法（不超过250字）：研究为单中心、开放标签、剂量递增的Ⅰ期临床试验，样本队列来源于美国国立卫生研究院临床中心收治的晚期实体瘤患者（NCT02423057）。采用Simon加速滴定设计中的设计4进行剂量递增，出现DLT后转为3+3设计，允许患者内剂量递增。安全性按美国国立癌症研究所常见不良事件术语标准（CTCAE）4.0版（2018年4月1日后为5.0版）分级，疗效按实体瘤疗效评价标准（RECIST）1.1版评估。采用CellSearch^?系统检测CTC中p16、细胞角蛋白（CK）及波形蛋白（V）表达作为药效学标志物。采用液相色谱-质谱联用（LC/MS）测定血浆及尿液中TdCyd及其代谢物TdUrd、TdThd浓度，并进行药代动力学参数计算。

研究结果：（1）患者人口学特征：27例患者中位年龄62岁（26–80岁），全部接受过既往化疗（中位3线，1–12线），24例（88.9%）接受过手术，11例（40.7%）接受过放疗；最常见恶性肿瘤为结肠腺癌（6/27，22.2%）、胆管癌（4/27，14.8%）、卵巢癌（3/27，11.1%）及肝细胞癌（2/27，7.4%）；多数患者基线ECOG体能状态为1。（2）毒性：全部患者可评估毒性，19例（70.3%）发生与研究药物可能相关的≥2级不良事件（AE），最常见为淋巴细胞减少（13例）、低磷血症（7例）及疲乏（6例）；≥3级药物相关AE最高发生率与最高剂量（14–20 mg）相关，最常见为淋巴细胞减少（9例）、血小板减少及天冬氨酸氨基转移酶升高（各4例）；1例DLT；4例减量，5例退出，8例死亡（7例归因于疾病进展，1例胆管癌患者死于感染性休克，不能排除TdCyd的潜在因果关联）；2例发生PJP。（3）临床结局：23例可评估疗效，最佳疗效为SD延长（中位4.5周期，范围2–18周期），见于10例（43.5%）；3例SD≥6周期，分别为腺泡状软组织肉瘤（ASPS，18周期，起始2 mg）、结肠腺癌（0.5 mg）及恶性副神经节瘤（20 mg，后减至6 mg）；TdCyd剂量与缓解持续时间无相关性；9例SD患者中3例（33.3%）出现0.5–14%的肿瘤缩小，3例持久SD患者均无肿瘤缩小；13例（56.5%）疾病进展，多发生于≥4线既往系统治疗患者（与SD患者相比差异有统计学意义，p=0.0199）。（4）药效学分析：21例可评估CK⁺CTC的p16反应，15例（71.4%）出现治疗相关p16⁺CK⁺CTC比例升高，包括全部3例持久SD患者；患者03和05的p16⁺CK⁺CTC比例分别于治疗8和7周期后达峰约80%；患者05在2 mg升至12 mg前达峰，其后降至20–30%且与剂量无关；患者10于第10周期缓慢升至约40%，第8周期由20 mg减至6 mg未受影响；2例肿瘤缩小患者在C3D1时出现CK⁺CTC的p16再表达，第3例未见；肿瘤缩小程度与p16⁺CK⁺CTC比例无相关性；V⁺CTC中p16再表达见于16例可评估者中的6例（37.5%），包括2例持久SD患者，与剂量无相关性。（5）药代动力学分析：TdCyd在多数样本中低于LOQ，无法计算消除半衰期；TdUrd约60 min达峰约1 μM，消除半衰期7.2 h，基本呈剂量比例，最高中位C_max见于最高剂量；TdThd在≥10 mg时超过LOQ，亦基本呈剂量比例，消除半衰期无法计算；TdUrd与TdThd水平在≥2级药物相关AE更多的患者中更高，但研究不足以评价正式关联；尿液中仅TdUrd被回收，回收比例与剂量无相关性。

讨论与结论：TdCyd凭借更高的DNA掺入率且不抑制DNA合成而优于FDA批准的DNMT抑制剂；临床前研究显示，在延长方案中耐受良好的剂量下，TdCyd通过耗竭DNMT1抑制小鼠模型肿瘤生长，但本研究未采集活检以证实该机制。研究入组27例重度既往治疗患者（中位3线，1–12线），23例可评估疗效；因行政原因在确定MTD前关闭，无法确定剂量-疗效关系。最高测试剂量为20 mg，研究人员注意到6 mg与10 mg剂量耐受性最佳，故建议未来剂量范围探索试验以6–10 mg（DL5/5A与DL6A）为起始剂量；>14 mg（DL7A）导致更高血液学毒性，属已知类别效应；最常见≥3级药物相关AE（淋巴细胞减少、血小板减少、天冬氨酸氨基转移酶升高）与该类药物安全性特征一致。2例非HIV感染患者发生PJP，归因困难且涉及多种共病因素，导致方案重大修改（加入PJP预防及延长DLT评估期）；预防引入后无新发PJP，但预防相关AE促使重新评估风险获益并移除预防。最佳疗效为SD（10/23，43.5%），3例持久SD≥6周期，SD持续时间不呈剂量依赖；快速进展主要见于≥4线既往治疗患者，研究人员认为这更可能是总体预后因素而非TdCyd的特异性预测因素。由于DNMT1靶点结合的证实受患者间DNMT1降解与反弹动力学异质性影响，研究人员改用CTC p16表达这一其他DNMT抑制剂已确立的药效学标志物；数据提示TdCyd即使在最低测试剂量下对CK⁺CTC亦具表观遗传活性，剂量调整似不影响药效学反应，肿瘤缩小与p16⁺CK⁺CTC比例无相关性；据此研究人员假设进一步评估低剂量TdCyd联合治疗有价值，未来研究可监测TdCyd介导的表观遗传调控作为药物活性潜在标志物；CK⁺与V⁺CTC间p16再表达率的差异在其他DNMT抑制剂试验中亦有报道，可能反映间质样V⁺CTC普遍更具耐药表型；临床前研究证实低至1 mg/kg与2 mg/kg（人体等效剂量分别为3 mg/m²与6 mg/m²）即可致肿瘤p16去甲基化。上述临床前与临床结果虽不构成TdCyd直接靶点结合的证据，药效学分析亦为假设生成而非确证性设计，但提示低剂量长时间暴露值得进一步评估，以期在不增加剂量的情况下改善临床疗效与耐受性。药代动力学方面，TdCyd在>6 mg剂量可稳定检出，>12 mg超过LOQ；TdUrd为主要循环代谢物，基本呈剂量比例，提示TdCyd是胞苷脱氨酶的良好底物、胸苷磷酸化酶的不良底物，但是胸苷激酶及（作为单磷酸）胸苷合成酶的底物；TdThd在≥10 mg给药后约2–3 h超过LOQ，且在AE更多更重的患者中水平更高，研究不足以评价其与毒性的正式关联；这些观察与小鼠研究一致，即TdUrd与TdThd血浆浓度快速升高、2 h内达平台并维持相对稳定达24 h；NCI临床前研究显示TdCyd与TdThd均可掺入DNA，机制类似吉西他滨，但似不作为链终止剂；接受第二代脱氧胞苷衍生物FdCyd的患者血浆中未常规检出胸苷代谢物，研究人员假设TdThd蓄积参与本研究TdCyd相关AE；未来需药代动力学研究验证TdThd蓄积对TdCyd毒性的潜在贡献及TdCyd代谢影响DNMT1耗竭的机制；加入胞苷脱氨酶强效抑制剂四氢尿苷（THU）可能减少TdThd形成并改善耐受性，但临床前数据显示THU共给药使TdCyd暴露大幅增加（AUC最高达20倍）同时降低其抗肿瘤效应，故临床计划未纳入THU；既往临床经验亦提示THU与核苷类似物FdCyd联用与更高DLT发生相关，可能与脱氧胞苷类似物暴露延长及磷酸化代谢物生成增加有关。研究显示TdCyd至少至20 mg可安全给药，但增加剂量未改善疗效，反而增加药物相关AE数量及潜在毒性TdThd血浆水平；CK⁺CTC中p16再表达在所有测试剂量均有记录，但该探索性终点与疗效及缓解持续时间无相关性。研究人员假设低浓度更长时间暴露可能对患者有益，这也与近期新型靶向肿瘤药物剂量优化与剂量选择范式转变相符；既往报道提示DNMT1抑制剂需延长给药才可能产生和/或维持临床缓解（包括延迟缓解），可解释为DNMT1耗竭剂需多轮细胞分裂才能再表达肿瘤抑制基因；此外本研究中<14 mg剂量患者耐受性更好。未来TdCyd研究需采用灵活统计设计以探索延迟毒性及疗效，允许确定最佳生物学剂量而非MTD；鉴于疗效可能受预后因素影响，未来剂量探索研究可考虑将患者随机分配至不同剂量。NIH正在开展的临床研究亦在评估其他第二代低甲基化药物，如5-氮杂-4'-硫代-2'-脱氧胞苷（Aza-TdC）（NCT03366116），其单药疗效更高，临床前研究中亦与TdCyd联用。TdCyd用于实体瘤的其他临床途径可包括靶向免疫激活的联合治疗（如与JAK1/2小分子抑制剂联用）或免疫检查点抑制剂联用，或与其他表观遗传调节剂如HDAC3抑制剂及EZH1/2抑制剂联用。研究结论：较低TdCyd剂量水平下出现的SD延长及p16再表达提示，未来试验值得探索低浓度长时间暴露，包括TdCyd联合治疗研究。