Simarouba glauca介导合成原始及PEG功能化金纳米粒：理化表征、计算分析、抗菌与抗癌活性

《Bioscience Nanotechnology》：Simarouba glauca-mediated synthesis of pristine and PEG-functionalized gold nanoparticles: physicochemical characterisation, computational analysis, antimicrobial and anticancer activities

　　

宫颈癌仍是重大健康问题，尤其在发展中国家。金纳米粒（AuNPs）因生物相容性和光学特性在靶向癌症治疗中具有潜力。本研究采用^{Simarouba glauca}乙醇叶提取物绿色合成原始AuNPs（Pristine-AuNPs），随后经聚乙二醇（PEG）后合成处理制备PEG功能化AuNPs。提取物总酚含量为28 mg GAE g^?1，DPPH自由基清除活性为82.68%。傅里叶变换红外光谱（FTIR）表征了叶提取物及PEG功能化AuNPs中的官能团。气相色谱-质谱（GC–MS）分析提供了暂定库匹配结果，随后采用SwissADME、SwissTargetPrediction和分子对接评估所选分子候选物的预测药代动力学性质及潜在蛋白相互作用。乙烷,1,1-二乙氧基-与Nischarin PX结构域（PDB ID: 3P0C）的探索性对接产生了最低计算结合能估计值?3.64 kcal mol^?1。紫外-可见光谱、X射线衍射（XRD）、扫描电子显微镜耦合能量色散X射线光谱（SEM–EDX）、动态光散射（DLS）、Zeta电位和透射电子显微镜（TEM）分析支持了AuNP的形成。基于MTT法，PEG功能化AuNPs对HeLa细胞相对活力产生浓度依赖性降低，在30 μg mL^?1时达到49.96%。合成的AuNPs还被用于对^{Micrococcus luteus}的抗菌效果评价，原始和PEG功能化AuNPs均表现出抑菌圈。

宫颈癌是全球女性第四大常见癌症，2022年新增约660,000例、死亡350,000例，在低中收入国家尤为突出。高危型人乳头瘤病毒（HPV）持续感染，尤其是HPV-16和HPV-18，是宫颈癌发生的主要病因。现有治疗虽为疾病管理所必需，但治疗相关毒性和递送局限性持续推动补充生物医学方法的研究。在此背景下，纳米技术成为癌症治疗的新兴有前景工具，其中金纳米粒（AuNPs）因独特的光学、热学和化学性质适用于成像、药物递送和光热治疗。多种金属和金属氧化物纳米粒通过增强活性氧（ROS）生成、氧化应激介导的线粒体损伤、DNA断裂、细胞周期进程破坏和凋亡诱导等机制发挥抗癌作用。AuNPs因优异的生物相容性、化学惰性、绿色合成便利性和强表面等离子体共振特性而尤为突出。然而，原始AuNPs在生理环境中常面临聚集、循环时间短和网状内皮系统（RES）非特异性摄取等问题，限制了其生物学性能。因此，聚乙二醇（PEG）表面功能化是广泛报道的策略，可增强AuNPs的胶体稳定性、生物相容性和循环时间，同时减少非特异性细胞摄取。植物介导合成提供了简单、经济、可扩展的纳米粒生产途径，植物提取物中的酚类和黄酮类等植物化学物可促进金属离子还原和纳米粒稳定化。^{Simarouba glauca}因其药用价值和多样植物化学成分成为绿色AuNP合成的有前景来源。既往研究已证明使用^{S. glauca}叶提取物合成金及其他金属纳米粒的可行性及其抗菌活性，也评估了^{S. glauca}叶提取物合成的AgNPs、ZnO、CuO等纳米粒的抗癌活性。然而，据研究人员所知，尚无先前研究报道使用^{S. glauca}叶提取物合成的PEG功能化AuNPs对HeLa细胞的体外细胞毒性。因此，本研究通过评估PEG功能化^{S. glauca}介导AuNPs对HeLa宫颈癌细胞的细胞毒性潜力来填补这一特定研究空白。研究将^{S. glauca}乙醇叶提取物表征与原始及PEG功能化AuNPs的制备和评价相结合，两种AuNP制剂均通过紫外-可见光谱、XRD、SEM–EDX和TEM表征，DLS和Zeta电位测量表征分散性，FTIR检查PEG处理制剂，并针对选定细菌和真菌菌株评价，HeLa细胞毒性试验仅评估PEG功能化制剂。此外，所选暂定GC–MS库候选物通过分子性质预测、靶点预测和探索性分子对接单独检查，以评估其预测性质和可能的蛋白相互作用。工作假设是后合成PEG处理可能改变植物介导制剂的光学和颗粒相关特征。这一整合设计结合了提取物化学、纳米粒表征、制剂特异性生物学评价和计算评估，同时区分实验发现与计算假设。

研究人员开展的关键技术方法包括：采用^{Simarouba glauca}叶乙醇提取物绿色合成原始AuNPs，随后用PEG-1000进行后合成功能化；通过紫外-可见光谱、XRD、SEM–EDX、TEM、DLS和Zeta电位进行理化表征；采用Folin-Ciocalteu法测定总酚含量，DPPH法评估抗氧化活性；通过FTIR和GC–MS分析提取物成分；采用SwissADME、SwissTargetPrediction和AutoDock 4.2.6进行计算机模拟分析；通过MTT法评估PEG功能化AuNPs对HeLa细胞的细胞毒性；采用琼脂孔扩散法和肉汤浊度法评估对^{Micrococcus luteus}的抗菌活性。植物材料采集自印度恰蒂斯加尔邦赖布尔（GPS坐标：21.2514° N, 81.6296° E）。HeLa细胞系购自印度勒克瑙Akaar Biotech。

研究结果如下：

植物化学分析：定性筛选检测到单宁、酚类、黄酮类、糖苷、蛋白质、氨基酸、碳水化合物、皂苷、香豆素、醌类、强心苷和淀粉，而花青素、蒽醌、木质素、三萜类、植物甾醇和间苯三酚鞣质未检出。总酚含量为28 ± 0.62 mg GAE g^?1提取物，DPPH自由基清除活性为82.68%，表明较强的自由基清除能力。

FTIR分析：叶提取物在3280.817 cm^?1处显示氢键O–H伸缩振动宽吸收带，2917.136和2849.083 cm^?1处为脂肪族C–H伸缩振动，1616.704 cm^?1处提示C=C或C=O伸缩振动，指纹区1315.742、1157.340和1030.809 cm^?1提示醚、醇或胺官能团。

GC–MS分析：在2.01至8.33 min之间产生72个积分色谱特征。5.47和5.55 min处特征分别占总积分面积59.76%和34.11%，邻苯二甲酸二乙酯为两者的主要库候选物，搜索概率分别为67.64和68.68。乙烷,1,1-二乙氧基-为2.01 min处特征的库候选物，搜索概率20.31，相似性/反向相似性指数662/793。2.26 min处3,8,12-三-O-乙酰基-7-脱氧英戈尔-7-酮为替代库候选物，搜索概率6.27，相似性/反向相似性指数582/620。基于可用候选结构及其与提交计算输入的对应关系，乙烷,1,1-二乙氧基-和英戈尔衍生物被选用于后续结构水平探索性计算分析。

计算预测与分子对接：乙烷,1,1-二乙氧基-分子量118.17 g mol^?1，8个重原子，2个氢键受体，拓扑极性表面积（TPSA）18.46 ?²；英戈尔衍生物分子量490.55 g mol^?1，35个重原子，9个氢键受体，TPSA 125.57 ?²。两者均不含氢键供体或芳香重原子。乙烷,1,1-二乙氧基-的sp³杂化碳分数为1.00，英戈尔衍生物为0.73；可旋转键分别为4和6。五种亲脂性模型一致预测英戈尔衍生物log P更高，共识log P分别为1.29和2.59。三种模型均预测乙烷,1,1-二乙氧基-水溶性显著更高（ESOL、Ali和SILICOS-IT分别预测17.2、18.3和5.54 mg mL^?1），英戈尔衍生物对应值为0.0446、0.00870和0.108 mg mL^?1。SwissADME预测两者均高胃肠道吸收，乙烷,1,1-二乙氧基-为血脑屏障（BBB）渗透性，英戈尔衍生物为非渗透性。两者均预测为非P-糖蛋白（P-gp）底物，对CYP1A2、CYP2C19、CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4无抑制预测。皮肤渗透系数log Kp分别为?6.42和?7.54。两者均满足Lipinski、Veber和Egan过滤器，预测生物利用度评分均为0.55。乙烷,1,1-二乙氧基-因分子量和摩尔折射率低于指定下限而未通过Ghose过滤器，因分子量低于200 g mol^?1而未通过Muegge过滤器；英戈尔衍生物超过Ghose分子量限值480 g mol^?1但满足Muegge标准。SwissTargetPrediction预测乙烷,1,1-二乙氧基-的靶点为Nischarin（NISCH；UniProt Q9Y2I1），预测概率0.02383；英戈尔衍生物的11β-羟基类固醇脱氢酶1型（HSD11B1；P28845）和环氧合酶-2（PTGS2；P35354）预测概率最高，均为0.11935。乙烷,1,1-二乙氧基-与人Nischarin PX结构域（PDB ID: 3P0C）对接，10次运行中第4次运行产生最低计算结合能估计值?3.64 kcal mol^?1，对应298.15 K时评分衍生Ki为2.15 mM。计算分子间能量为?4.83 kcal mol^?1，包括范德华力、氢键和去溶剂化贡献?4.55 kcal mol^?1及静电贡献?0.28 kcal mol^?1，扭转自由能贡献为+1.19 kcal mol^?1。二维相互作用图显示B链Thr31和Lys75的预测氢键接触，以及Tyr30和Leu26的疏水接触，邻近残基包括Arg49、Tyr50、Tyr33、Ser81和Thr29。10次对接运行在2.0 ? RMSD容差下形成6个簇，最低能量簇含3个构象，平均能量?3.54 kcal mol^?1，第二簇含2个构象，最低能量?3.61 kcal mol^?1。

原始和PEG功能化AuNPs的表征：紫外-可见光谱显示原始和PEG功能化AuNPs分别在约530和540 nm处出现弱而宽的局域表面等离子体共振（LSPR）特征，PEG功能化AuNPs的LSPR峰稍尖锐且强度更高，约10 nm红移提示PEG相关表面修饰。XRD显示两者均具有面心立方（FCC）金特征衍射反射，原始AuNPs峰位于约38.42°、44.52°、64.88°和77.79°，对应（111）、（200）、（220）和（311）晶面；PEG功能化AuNPs峰位于38.36°、44.50°、64.84°和77.78°。Debye–Scherrer方程计算表明原始和PEG功能化AuNPs（111）面表观微晶尺寸分别为10.30和11.13 nm，晶面间距分别为0.23411和0.23446 nm。SEM显示两者均呈圆形颗粒特征，紧密堆积区域与间隙并存。EDX分析显示原始AuNPs金重量百分比94.7%、原子百分比53.6%，碳、氧、钠和氯重量百分比分别为4.3%、0.7%、0.3%和0.1%；PEG功能化AuNPs金重量百分比94.5%、原子百分比53.1%，碳和氧重量百分比分别为4.3%和0.7%，钠和氯分别为0.3%和0.1%。TEM显示两者均呈圆形、准球形和多面体颗粒，原始AuNPs平均测量粒径23.81 ± 8.28 nm（n=35），PEG功能化AuNPs为27.07 ± 5.23 nm（n=37），后者相对尺寸分布更窄。HRTEM显示两者均具有分辨晶格条纹，SAED图案含同心环和离散亮点，与XRD鉴定的FCC Au相互补。DLS显示原始AuNPs Z-平均流体动力学直径987.3 nm，多分散性指数（PDI）0.7094，强度分布主要群体 centred at 658.2和66.94 nm，分别贡献52.7%和39.88%散射强度；PEG-AuNPs Z-平均直径102.1 nm，PDI 0.5629，强度分布峰位于233.2和32.75 nm，分别占76.34%和22.32%。PEG功能化后Z-平均直径和PDI显著降低，提示颗粒缔合减少。Zeta电位显示原始和PEG功能化AuNPs平均Zeta电位分别为?15.05和?15.76 mV，PEG功能化引起0.71 mV向更负方向的微小偏移，电导率分别为0.6591和0.3387 mS cm^?1。FTIR显示PEG功能化AuNPs在2321、2102、1982和873 cm^?1处显著特征，以及约1372、1645、2905和3230–3390 cm^?1处弱特征，与^{S. glauca}叶提取物光谱和PEG相关系统报道特征相近，支持PEG相关振动特征的可能贡献及植物来源有机成分的贡献。

生物学活性：MTT法显示PEG功能化AuNPs对HeLa细胞活力产生浓度依赖性降低。1 μg/mL时无细胞毒性效应（100.09%），5 μg/mL为89.04%，10 μg/mL为86.88%，15 μg/mL为72.11%，20 μg/mL为57.76%，25 μg/mL为52.50%，30 μg/mL为49.96%。最大降幅发生在10至20 μg/mL之间，平均细胞活力从86.88%降至57.76%，降低29.12个百分点。抗菌活性评估显示，琼脂孔扩散法中原始AuNPs对^{Micrococcus luteus}产生约1 mm抑菌圈，PEG功能化AuNPs产生近2.5 mm较大抑菌圈。肉汤浊度法中，24 h时阳性对照OD₆₀₀为0.907，原始AuNPs（1 mL和0.5 mL）OD值分别为0.835和0.899，抑制率分别为7.94%和0.88%；PEG功能化AuNPs OD值降至0.501和0.624，抑制率分别为44.76%和31.20%。48 h时阳性对照OD增至1.16，原始AuNPs（1 mL）OD降至0.60，抑制率48.28%，0.5 mL抑制率25.17%；PEG功能化AuNPs OD值为0.504和0.685，最大抑制率分别为56.55%和40.95%。较高浓度（1 mL）始终比较低浓度（0.5 mL）产生更大抗菌功效。PEG功能化AuNPs表现出更快和更高的初始抗菌活性，而原始AuNPs在48 h内表现出渐进的时间依赖性增强。

讨论部分总结：本研究利用^{Simarouba glauca}叶提取物合成原始AuNPs，随后进行后合成PEG功能化。植物化学筛选、酚含量分析、抗氧化评估、FTIR和GC–MS表征了叶提取物。紫外-可见光谱、XRD、电子显微镜和EDX支持了AuNP形成、结晶FCC结构和富金元素组成。PEG功能化AuNPs显示比原始AuNPs更低的Z-平均流体动力学直径和PDI，提示测量条件下颗粒缔合减少，而两者表现出相似的负Zeta电位。两种制剂均对^{Micrococcus luteus}显示抑制作用，PEG功能化制剂产生更大抑菌圈和更高表观OD基生长抑制。PEG功能化AuNPs还对HeLa细胞MTT反应产生浓度依赖性降低，24 h后30 μg/mL时相对活力达49.96%。计算分析描述了所选暂定GC–MS候选物的预测分子性质和潜在蛋白相互作用，乙烷,1,1-二乙氧基-与Nischarin PX结构域显示 modest 计算相互作用。总之，这些发现表征了植物介导AuNP制剂及其制剂依赖性理化和生物学响应。研究结论翻译：^{Simarouba glauca}叶提取物用于合成原始AuNPs，随后进行后合成PEG功能化。植物化学筛选、酚含量分析、抗氧化评估、FTIR和GC–MS表征了叶提取物。紫外-可见光谱、XRD、电子显微镜和EDX支持了AuNP形成、结晶FCC结构和富金元素组成。PEG功能化AuNPs显示比原始AuNPs更低的Z-平均流体动力学直径和PDI，提示测量条件下颗粒缔合减少，而两种制剂表现出相似的负Zeta电位。两种制剂均对^{Micrococcus luteus}显示抑制作用，PEG功能化制剂产生更大抑菌圈和更高表观OD基生长抑制。PEG功能化AuNPs还对HeLa细胞MTT反应产生浓度依赖性降低，24 h后30 μg/mL时相对活力达49.96%。计算分析描述了所选暂定GC–MS候选物的预测分子性质和潜在蛋白相互作用，乙烷,1,1-二乙氧基-与Nischarin PX结构域显示适度的计算相互作用。总之，这些发现表征了植物介导AuNP制剂及其制剂依赖性理化和生物学响应。