《BMC Veterinary Research》：Determination of reference intervals for symmetric dimethylarginine (SDMA) in Lacaune sheep
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传统生物标志物如血清肌酐（creatinine）和尿素（urea）往往无法反映早期肾功能障碍，尤其是在消瘦动物中，因为二者依赖于肌肉量或膳食蛋白质摄入。对称二甲基精氨酸（symmetric dimethylarginine，SDMA）作为一种新型肾脏生物标志物
传统生物标志物如血清肌酐（creatinine）和尿素（urea）往往无法反映早期肾功能障碍，尤其是在消瘦动物中，因为二者依赖于肌肉量或膳食蛋白质摄入。对称二甲基精氨酸（symmetric dimethylarginine，SDMA）作为一种新型肾脏生物标志物，已在其他物种中显示出对肾脏疾病更早期、更灵敏检测的应用前景。然而，绵羊物种中SDMA的参考区间尚未见文献记载。本研究旨在建立临床健康Lacaune绵羊血清SDMA的参考区间。依据临床健康状况、体况评分（body condition score，BCS）及血清肌酐浓度，选取了143只健康绵羊作为参考群体，并按年龄分层（幼年<1岁，成年≥1岁）。血清SDMA采用经猫和犬验证的酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）进行定量。计算得出参考区间：全部绵羊为0.59–1.72 μmol/l，成年羊为0.59–1.56 μmol/l，幼年羊为0.59–1.83 μmol/l，幼年羊浓度显著高于成年羊（p < 0.001）。未观察到性别相关差异。在对51只具有组织病理学肾脏评估的死亡绵羊进行的回顾性分析中，患有严重肾脏病变的动物SDMA浓度显著高于无病变、轻度或中度病变的动物（p = 0.005）。相比之下，肌酐未显示显著差异。值得注意的是，在体况较差的动物中，SDMA仍能有效识别患有严重肾脏病变的个体，而肌酐水平仍处于参考区间内或低于参考区间。这些发现表明，SDMA是比肌酐更灵敏的绵羊肾功能障碍指标，尤其是在消瘦个体中。所建立的参考区间为临床应用提供了基础。SDMA检测的经济可行性仍是一个局限，但其改善绵羊肾脏疾病早期诊断的潜力值得进一步研究。
**研究背景与问题**
绵羊的肾功能衰竭虽然在总体上较为罕见，但主要由细菌感染（如Clostridium perfringens D型引起的髓样肾病肠毒血症）、化学物质及植物毒素等因素导致的肾小管坏死所引起。然而，在常规兽医临床实践中，肾功能不全的诊断几乎总是归因于肾前性或肾后性因素。肾前性肾功能衰竭由肾脏功能性低灌注引起，可基于心功能不全、大量失血或脱水，后者常与低钙血症、瘤胃酸中毒或酮病合并出现。肾后性肾功能不全由下尿路梗阻导致尿潴留并压迫功能性肾组织所致，常见于去势公羊的梗阻性尿石症或老年母羊的子宫肿瘤压迫尿道。
监测肾功能是内科诊断流程和重症监护管理的基本要素。由于肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）的准确测定耗时且操作复杂，血浆尿素和肌酐浓度常被用作监测肾功能的近似参数。然而，这两种传统参数存在重要缺陷，使其在诊断背景下难以评估，并在许多情况下无法进行有意义的应用。尿素即血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN），作为氨基酸代谢的终产物，受膳食蛋白质摄入和饲料组成的强烈影响。肌酐是肌肉能量代谢的产物，其血清浓度与个体肌肉组织量直接成正比，因此血浆肌酐浓度在物种内可因品种、年龄和性别而异。此外，血浆肌酐与肌肉组织量的密切关系在绵羊中尤为突出，因为这些动物在重症监护时往往严重消瘦。脂肪储备丧失后，富含蛋白质的肌肉组织被分解代谢，导致血尿素浓度升高，同时少量肌肉组织无法提供足够的肌酐来充分反映肾脏滤过能力。根据物种不同，只有当肾小球滤过率降低超过约75%时，血浆肌酐浓度才会升至参考上限以上。慢性肾脏疾病的发生率在人医和兽医中均被大大低估，这在很大程度上归因于这一最常用参数的不准确性。
与胱抑素-C（cystatin-C）一样，对称二甲基精氨酸（SDMA）代表了新一代肾脏生物标志物，通过单次血液样本检测即可获得，有望实现肾功能障碍的早期和更灵敏识别。与肌酐不同，SDMA是所有有核细胞的产物，是氨基酸L-精氨酸的衍生物，由细胞核蛋白质代谢中的甲基化形成。蛋白水解后，SDMA进入血流，在人类中90%经肾脏排泄。尽管SDMA在50多年前即被首次描述，但直到21世纪初才在人医学中被解读为肾脏参数。在兽医领域，该参数约十年前已在猫和犬中确立应用。马和牛的血清SDMA研究也证实该参数是诊断相应物种肾功能障碍的有用工具。在山羊中，Camacho等计算了参考区间（0.4–1.3 μmol/l）。然而，迄今为止尚无绵羊应用的数据。
本研究旨在严格按照美国兽医临床病理学会（American Society for Veterinary Clinical Pathology，ASVCP）指南建立绵羊SDMA参考区间。为此，选取了160只临床健康的Lacaune绵羊作为参考群体。此外，本研究旨在检验SDMA在绵羊肾功能障碍早期检测中优于肌酐的假设诊断优势。为此，回顾性分析了51只具有病理学和组织病理学诊断数据的死亡绵羊患者的血清样本，以确定其肾功能状态。
**关键技术方法**
研究人员从单一奶牛场采集了160只临床健康Lacaune绵羊的血清样本（参考群体），样本来源于2024年夏季常规梅迪-维斯纳病监测和微量元素状态监测。参考群体个体依据四项预定义健康标准进一步筛选：临床外观无异常、体况评分（BCS）在2至4之间、FAMACHA评分≤2、血清肌酐浓度低于已发表参考上限（羔羊：130 μmol/l；成年羊：104 μmol/l）。最终有效参考群体为143只动物。第二部分研究回顾性分析了2018至2022年间就诊于小反刍动物兽医诊所的51只死亡绵羊患者（测试群体）的血清样本，主要纳入标准为可获得病理检查前48小时内采集的血清，所有动物均接受了专业兽医病理学家的病理学和组织病理学检查。血清SDMA浓度采用经兽医验证的商用ELISA试剂盒（SDMA Vet ELISA，DLD Diagnostika GmbH，Hamburg，Germany）测定。统计分析使用R环境（版本4.4.0）完成，参考区间以非参数方法计算为第5和第95百分位数，并采用bootstrap方法（1000次重采样，偏差校正加速法）估计90%置信区间。
**研究结果**
**绵羊SDMA参考区间的计算**
全部160只受检动物的肌酐浓度均低于Bickhardt等（羔羊：130 μmol/l）和Tschuor等（成年羊：104 μmol/l）发表的参考上限。若干个体因BCS低于2（n=10）和/或FAMACHA评分高于2（n=10）需排除，最终有效参考群体为143只动物。个体按年龄分为幼年（<1岁；31只雄性，32只雌性）和成年（≥1岁）。在全部临床健康个体（n=143）的数据集分析中，未观察到性别相关的血清SDMA浓度差异（p=0.53）。按年龄组分别分析时，成年羊和幼年羊中同样未观察到统计学显著的性别相关差异。然而，幼年动物的血清浓度显著高于成年绵羊（p<0.001）。在参考区间计算前，使用Tukey四分位距法识别出5个离群值并排除。基于剩余138只绵羊，建立了绵羊血清SDMA参考区间为0.59（90% CI：0.55—0.61）–1.72（90% CI：1.64—1.82）μmol/l（均值=1.09 μmol/l；中位数=1.04 μmol/l）。由于检测到幼年与成年动物间的显著差异，另行分别计算了成年羊（≥1岁）和幼年羊（<1岁）的参考区间。成年动物中，80只个体中2只被识别为离群值，基于剩余78只成年绵羊建立参考区间为0.59（90% CI：0.46—0.60）–1.56（90% CI：1.39—1.65）μmol/l（均值=0.99 μmol/l；中位数=0.97 μmol/l）。仅考虑幼年动物时，63只中3只被识别为离群值，基于剩余60只幼年绵羊确定参考区间为0.59（90% CI：0.51—0.74）–1.83（90% CI：1.83—2.24）μmol/l（均值=1.18 μmol/l；中位数=1.15 μmol/l）。
**临床队列**
不同肾脏病变类别间血清肌酐浓度无显著差异（配对Wilcoxon检验；p>0.57）。采用Tschuor等报道的参考区间，轻度病变动物中无一只（0/4）、中度病变中1只（1/6）、重度病变中3只（3/8）超过参考上限104 μmol/l。相比之下，患有严重肾脏病变的动物血清SDMA浓度显著高于无组织病理学异常的动物（p=0.005）以及轻度和中度病变动物（两项比较：p=0.048）。基于本研究建立的参考区间，轻度病变中1/4、中度病变中3/6、重度病变中7/8的动物超过参考上限1.72 μmol/l。33只无肾脏病变的动物中，13只SDMA浓度高于1.72 μmol/l。这13只动物中，11只被执行安乐死，2只自然死亡。最终诊断包括严重肺炎（4/13）、胃肠道感染（3/13）、严重贫血（2/13）、白血病（2/13）、子宫破裂（1/13）和利斯特菌病（1/13）。通过将血清肌酐和血清SDMA与体况作图，肌酐在体况较差的动物中显示较低水平，而SDMA不受影响。
**讨论部分总结**
由于参考区间是实验室检测的基本组成部分并构成临床决策的基础，建立参考区间的标准化方法对于确保结果的可靠性和可解释性至关重要。ASVCP建议参考群体应包含约120个个体，且人群特征应代表目标群体。本研究共纳入143只动物，满足该要求。性别和年龄分布反映了欧洲商业绵羊群的典型人口结构。按年龄组另行计算参考区间时，各亚组（80只成年羊和63只幼年羊）未达到推荐样本量。由于年龄特异组内数据近似正态分布，根据ASVCP指南，使用90%置信区间估计参考限可被认为是可以接受的。然而，由第5和第95百分位数定义的中心90%参考区间窄于传统的中心95%区间（第2.5–97.5百分位数），因此预计更多来自健康参考群体的值会落在这些限值之外，在解读SDMA浓度时尤其是接近参考限值时应考虑这一点。由于参考群体完全由Lacaune奶绵羊品种组成且来源于单一农场，数据集在品种和来源方面存在局限，因此在将所确定的参考区间外推至其他群体时需谨慎，尤其是肉用品种。另一个需要考虑的因素是，基于临床检查、体况评估和血清肌酐浓度的纳入标准可能无意中允许不健康个体的纳入。
SDMA的测量可采用不同分析方法。液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography–tandem mass spectrometry，LC–MS/MS）被认为是金标准，但ELISA在常规诊断中更为常用，因为多个制造商的商用试剂盒可获取且每样本成本大幅降低。然而应注意，基于ELISA的测量可能产生略高于LC–MS/MS的SDMA浓度。此外，本研究中使用的ELISA（DLD）迄今仅在犬和猫中验证，因此建立方法特异性参考区间尤为重要，并强烈建议将该方法与金标准进行验证。
本研究使用ELISA（DLD）法测定的临床健康Lacaune绵羊（雌雄兼有、不同年龄）血清SDMA参考区间为0.59–1.72 μmol/l，高于大多数先前报道的其他家养物种基于ELISA的参考区间。已描述肉食动物如犬（0.42–0.74 μmol/l）、猫（0.00–0.74 μmol/l）和雪貂（0.15–0.40 μmol/l），以及草食动物包括马（0.42–0.74 μmol/l）和兔（0.21–0.95 μmol/l）的较低参考范围。由于该试剂盒尚未在绵羊中针对LC–MS/MS进行验证，这一观察可能与方法学有关。对于家养反刍动物，目前关于生理性SDMA浓度的信息很少。在山羊中，Camacho等近期报道了基于55只不同品种雌雄成年动物的参考区间0.4–1.3 μmol/l，采用定量免疫分析（IDEXX）测定。此外，一项对24只成年Saanen山羊的代谢组学研究报道了LC–MS/MS测定的血清SDMA浓度为0.53–1.48 μmol/l。尽管这些值采用不同方法测定且略低于本研究建立的Lacaune绵羊全部年龄组的参考限值，但与本研究确定的成年动物参考区间（0.59–1.56 μmol/l）大体可比。小反刍动物中观察到的总体较高的SDMA浓度可能与这些物种相对较大的胃肠道有关，消化道高细胞量相对于体重可能产生不成比例的大量核代谢副产物如SDMA。
与本研究结果一致，其他动物物种的研究未报道性别间血清SDMA浓度的显著差异。然而应强调，本研究中雄性群体绝大多数为幼年雄性（31/40），性别特异性差异预计在成年动物中更为明显。年龄组间观察到显著差异：幼年绵羊血清SDMA浓度（0.59–1.83 μmol/l）显著高于成年动物（0.59–1.56 μmol/l）。马、犬和猫中也曾报道类似的年龄相关效应，幼年个体血清SDMA浓度显著高于成年个体。其潜在机制尚不完全清楚，但有人提出年龄相关的精氨酸甲基化和蛋白质代谢差异可能导致年轻动物SDMA释放增加，而肾脏排泄功能似已与成年动物相当。
基于51只临床患病并经病理学检查动物的回顾性分析，本研究中对SDMA与肌酐的比较评估必须仅被视为指示性的，不能替代使用更大研究群体和金标准方法（如肾小球滤过率测定）对绵羊该参数的验证。仅由于人口学差异（如品种组成、性别分布和年龄分布），临床队列与参考群体仅部分可比。此外，潜在的组织病理学发现并不总是反映肾功能，因为肾前性效应很少被捕捉。这可能解释为何一些无肾脏病变的动物表现出升高的血清SDMA浓度。此类发现在该群体中并不意外，该群体完全由采样后48小时内死亡或安乐死的动物组成。重症个体的脱水或休克导致的灌注障碍并不罕见。然而，该数据集提供了强有力的证据表明SDMA在体况较差的动物中优于肌酐。患有严重肾脏病变且血清肌酐浓度低的个体显示血清SDMA水平高于所建立的参考区间。这可能是由于血清肌酐对肌肉量的依赖，此处以临床评估的体况评分（BCS）近似表示。这种效应对于SDMA而言明显较弱，因为几乎所有患有严重肾脏病变的个体即使BCS较低也可通过高于参考区间的浓度被识别。
**研究结论翻译**
与大多数其他家养物种报道的参考区间相比，Lacaune绵羊测定的血清SDMA浓度略高。然而，所建立的成年绵羊参考范围与先前发表的山羊数据可比。由于SDMA是所有有核细胞的代谢产物，通过该参数评估绵羊肾功能也应比通过肌酐或血尿素氮（BUN）更为灵敏。然而，临床队列的评估仅提供初步指导，代表了验证SDMA在该物种中诊断应用的第一步。显然需要进一步研究。尽管如此，应用本文建立的血清SDMA参考区间表明具有良好的诊断效用，尤其是在体况较差的动物中。应考虑对幼年和成年动物分别设置参考区间，因为二者存在显著差异。限制该生物标志物在绵羊中应用的一个重要局限是经济性：目前，通过ELISA测定SDMA虽然比LC–MS/MS成本低，但仍显著贵于廉价的肌酐光度法评估。
