酪蛋白激酶II（CKII）与MAPK信号联合抑制作为转移性结直肠癌的治疗策略

《Experimental Hematology & Oncology》：Combined casein kinase II and MAPK signalling inhibition as a therapeutic strategy for metastatic colorectal cancer

背景：转移性结直肠癌（mCRC）因耐药性的出现仍是重大临床挑战，亟需新的治疗策略。蛋白质组的异常调控驱动癌症进展，解析这些改变为靶向干预提供了机会。本研究旨在鉴定mCRC中候选的激酶依赖性，并在患者来源模型中检验一种合理的联合策略。方法：研究人员对10例mCRC组织、其配对的患者来源类器官（PDOs）及正常结肠黏膜进行了蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析，并整合了全外显子组测序。激酶活性通过激酶-底物富集分析（KSEA）推断。在PDO队列及正常结肠PDOs中，通过离体药物筛选、western blot、流式细胞术和药物相互作用分析，评估了silmitasertib介导的酪蛋白激酶II（CKII）抑制（单药及联合MEK抑制剂trametinib）的效果。结果：PDOs重现了配对肿瘤的分子特征。组织和PDOs均显示CKII活性持续升高。Silmitasertib表现出异质性抗肿瘤活性，耐药性与MAPK及Akt-mTOR信号活性相关。Silmitasertib与trametinib联合对两条耐药相关通路产生加性抑制作用，而对正常结肠PDOs的活力影响很小。该联合还显著降低了CKII活性、活性β-catenin丰度及结直肠癌干细胞池。结论：磷酸化蛋白质组学分析确定CKII为mCRC的治疗脆弱性靶点，并为silmitasertib联合MEK抑制提供了理论依据，为mCRC提供了一种候选联合策略。

研究背景：结直肠癌（CRC）是全球第三大常见诊断癌症及第二大癌症死亡原因，转移是CRC患者死亡的主要原因，肝脏为最常见的远处转移部位。约20%的CRC患者初诊时即存在转移，而高达60%的患者在首次治疗干预后5年内发生远处转移。当前标准化疗方案下，转移性CRC（mCRC）患者的中位总生存期约为30个月。在一线和二线治疗后，三线或四线治疗的选择面临挑战，现有选项包括TAS-102、瑞戈非尼或既往化疗再挑战联合或不联合靶向治疗。然而，耐药性的频繁出现仍是重大临床挑战，目前致力于测试具有加性/协同疗效且理想情况下毒性不重叠的新型联合疗法。患者来源类器官（PDOs）是能够重现肿瘤组织异质性和结构的复杂模型，多项研究已验证PDOs预测治疗反应的准确性和敏感性，尤其在CRC背景下。来自CRC肝转移的大规模PDO生物样本库进一步确立了其作为功能性精准肿瘤学和患者分层资源的价值。然而，鉴定能够指导mCRC合理联合治疗的保守分子脆弱性仍是一个开放挑战。（磷酸化）蛋白质组网络的异常调控参与癌症发生和进展，基于质谱的技术进步结合基因组、表观基因组和转录组数据的整合，为揭示癌症脆弱性和指导治疗策略提供了机会。药物发现由鉴定具有有益药理活性的新分子驱动，但将具有治疗潜力的新分子推向临床的成功越来越困难，因此联合两种或多种药物可能在药物治疗中产生多重有利影响。本研究评估了10例mCRC患者队列的（磷酸化）蛋白质组特征，发现CRC组织和PDOs均表现出高酪蛋白激酶II（CKII）相关信号以及Akt-mTOR和细胞周期相关通路。最后，研究人员在离体PDO模型上评估了不同单药和联合治疗的疗效，为基于磷酸化蛋白质组数据的mCRC患者个性化治疗方案设计提供概念验证。

研究人员开展的研究及结论与意义：本研究通过磷酸化蛋白质组学引导的方法，鉴定CKII为mCRC的治疗脆弱性靶点，并证明silmitasertib与trametinib联合具有加性至协同的抗肿瘤效果，同时降低活性β-catenin丰度和结直肠癌干细胞池，而对正常结肠PDOs毒性有限。该研究为mCRC提供了一种候选联合治疗策略，论文发表在《Experimental Hematology》。

关键技术方法：研究纳入了10例mCRC肝转移组织和6例正常结肠黏膜（来自16例于瑞士巴塞尔Clarunis接受手术的CRC患者），以及一个独立的验证队列（6例CRC肝转移PDOs，其中3例来自意大利Humanitas研究医院，3例来自巴塞尔Clarunis；另2例原发结直肠肿瘤及正常结肠黏膜用于建立PDO系P134和P135，正常结肠PDO系P645来自Clarunis）。主要技术方法包括：蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析（基于LC-MS/MS，使用Orbitrap Fusion Lumos质谱仪，进行Fe(III)-IMAC磷酸肽富集，定量4254种蛋白质和6964个磷酸化位点）；全外显子组测序（对8例CRC组织及配对PDOs进行，外周血作为胚系对照）；激酶-底物富集分析（KSEA）；离体药物筛选（CellTiter-Glo检测细胞活力）；western blot；流式细胞术（细胞周期DAPI检测及CD44/CD133干细胞标志物分析）；RT-qPCR；免疫组化；药物相互作用分析（SynergyFinder 3.0，采用HSA、Bliss、Loewe和ZIP模型）。

研究结果：

建立和表征转移性结直肠癌组织的患者来源类器官：研究人员从10例CRC患者肝转移手术切除标本中生成PDO培养物，除P17外所有mCRC PDOs均显示长期扩增能力。组织病理学表征显示PDOs紧密镜像配对肿瘤的腺癌结构和细胞形态，包括程度不一的腺体结构、核深染和高核质比。PDOs保留CDX2和CK20表达模式，确认其结直肠组织来源，并重现配对组织的微卫星稳定性状态（除P22为MLH1和PMS2阴性外均为微卫星稳定）。全外显子组测序显示CRC驱动基因突变在所有测序PDOs中得以保留，APC和TP53突变患病率72%，三分之一患者具有致癌性KRAS突变（P15和P31为G12D，P117为G13D）。三个随机选取患者的PDOs在短期和长期传代阶段均保留所有驱动突变。蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析显示，在队列水平上，PDOs和肿瘤组织相对于正常结肠黏膜的蛋白质组和磷酸化蛋白质组整体失调得以保留（Spearman R分别为0.57和0.66）。通路富集分析揭示PDOs和肿瘤中mCRC相关通路高度一致，如MYC靶点上调、G2M检查点、WNT信号和MTORC1信号。与PDO模型相比，肿瘤和结肠黏膜组织显示基质和免疫相关通路蛋白表达更高，导致高免疫和基质评分，这与离体PDO模型缺乏免疫和基质成分一致。含肿瘤样本（肿瘤组织和PDOs）DNA复制相关蛋白表达更高。对样本组间系统差异进行批次校正后，配对肿瘤和PDOs在蛋白质组和磷酸化蛋白质组水平显示高度相似性。总之，尽管PDOs不保留免疫和基质成分，但准确镜像了其来源mCRC肿瘤组织的组织学和分子特征，支持其作为mCRC代表性模型和临床前工具的相关性。

CKII活性在转移性CRC组织和PDOs中上调：研究人员通过分析mCRC组织和配对PDOs的蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱，研究其推定失调的信号和活性。在两种模型中，对差异调控磷酸化位点的KSEA鉴定出CSNK2A1为最活跃的激酶亚基之一（无论是否将磷酸化底物水平对蛋白质丰度归一化），而其他参与增殖通路的激酶如细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK1）仅在未归一化时显示富集。对PDO队列进行分组分析，发现CKII为最活跃激酶之一。通过研究CKII特异性磷酸化底物池，分析显示三十个差异磷酸化最强的CKII底物中大多数（77%）仅被CKII催化亚基磷酸化，增强了数据集可靠性。研究人员还观察到与两个已知调节和增强CKII活性的蛋白质因子CSNK2B和NELFE的正相关。为验证发现，研究人员检测了PDO队列和正常结肠黏膜细胞系NCM460中CKII特异性底物的磷酸化状态作为CKII活性指标，确认PDO模型中CKII特异性底物磷酸化水平显著高于NCM460。有趣的是，CKII特异性底物磷酸化越高对应CKIIα亚基表达水平越高。总之，蛋白质和磷酸化位点表征揭示mCRC患者队列中多种失调通路和激酶活性，特别是一致指向转移性CRC组织和配对PDOs中CKII的过度激活。

Silmitasertib在mCRC PDOs中发挥抗肿瘤作用并诱导DNA损伤和凋亡：研究人员决定研究靶向CKII和CDK1激酶（归一化和非归一化激酶活性分析后的顶级候选）的抗肿瘤疗效，分别选择silmitasertib和dinaciclib。两者均为临床阶段抑制剂，已获FDA孤儿药资格认定，并已在临床试验中评估（包括实体恶性肿瘤）。为探索CRC PDOs治疗的药物动态范围，研究人员首先在具有不同驱动突变和特征的小型永生化CRC细胞系面板上筛选其疗效。Silmitasertib处理在30 μM浓度对mCRC PDOs显示显著抗肿瘤活性，在10 μM浓度观察到患者特异性耐药/敏感。正常结肠PDOs对10 μM不敏感，对30 μM轻微敏感，表明silmitasertib在反映临床研究中观察到的生理药代动力学的浓度下对正常结肠类器官活力影响很小。比较mCRC和正常结肠PDOs的CKII特异性底物磷酸化，确认肿瘤来源细胞系中CKII信号活性更高。另一方面，dinaciclib对细胞和PDO系均发挥显著抗肿瘤作用，但在相同浓度范围内观察到正常结肠PDO活力显著降低。基于这些结果，研究人员进一步研究10 μM silmitasertib异质性反应的分子差异。Western blot定量显示silmitasertib处理后CKII底物磷酸化水平（以下简称"CKII信号"）在分组和配对比较中均降低（p=0.001和p=0.004）。值得注意的是，CKII信号降低与silmitasertib抗肿瘤活性强相关（R=0.89，p=0.0013），表明silmitasertib的抗肿瘤效应与CKII信号抑制相关。相反，silmitasertib未显著降低正常结肠PDOs中的CKII信号（除基线水平最高的P134系外），且不影响其活力或细胞周期分布，表明与mCRC PDOs不同，正常结肠上皮对CKII活性依赖较小。为探索CKII抑制对原发CRC的潜在作用，研究人员评估了对独立队列两个原发结直肠肿瘤PDO系（P130和P255）的细胞毒性作用，两系对silmitasertib显示相反敏感性，P130比P255更耐药。与mCRC处理PDOs中观察一致，最耐药PDO在silmitasertib处理后保留更高CKII信号（P130降低39%±9% vs P255降低56%±4%）。鉴于CKII在调节细胞周期进程中的已知作用，研究人员检查silmitasertib对细胞周期调控的影响。通过DAPI驱动流式细胞术分析直接评估细胞周期状态，观察到silmitasertib处理显著增加G2/M期阻滞细胞比例（p=0.008），相反降低G1期细胞比例（p<0.05）。特别地，silmitasertib耐药PDOs表现出更高的G2/M期增加（R=?0.67，p=0.046）和更高的G1期细胞减少（R=?0.75，p=0.020）。另一方面，三个正常结肠PDO系的细胞周期谱未受扰动。由于CKII参与DNA修复及其通过磷酸化蛋白质切割位点抑制caspase介导切割的能力，研究人员假设silmitasertib处理可能增加DNA损伤和程序性细胞死亡，因此通过测量磷酸化H2AX组蛋白变体（γ-H2AX，DNA双链断裂标志物）水平和PARP切割率（凋亡级联激活标志物）评估PDOs的DNA损伤状态。Western blot分析显示silmitasertib处理显著增加DNA损伤（p=0.03）并诱导PARP切割（p=0.008），表明凋亡级联激活，耐药PDOs显示处理后PARP切割诱导有限（R=0.65，p=0.060）。与CKII在DNA修复机制中的作用一致，研究人员观察到silmitasertib疗效与DNA修复通路活性正相关（DNA修复R=0.78，p=0.013；核苷酸切除修复R=0.73，p=0.027），表明DNA修复活性高的癌细胞可能对silmitasertib介导的CKII抑制更敏感。总之，结果表明silmitasertib通过干扰细胞周期动态及促进凋亡和DNA损伤诱导，在PDO队列中发挥异质性抗肿瘤活性。这些数据为DNA损伤诱导剂与CKII抑制的联合治疗奠定了基础。

MAPK和Akt-mTOR信号与silmitasertib抗癌疗效相关：上述观察促使研究人员研究平行机制是否可能限制silmitasertib介导的CKII通路抑制。应用于磷酸化蛋白质组数据集的通路富集分析显示，PDOs和组织中细胞周期调控和增殖相关通路显著富集，包括MAPK相关信号通路。鉴于MAPK信号在促进癌症发生、进展和耐药机制中的已知作用，研究人员决定进一步解析该通路在潜在驱动silmitasertib耐药中的参与。研究人员询问（磷酸化）蛋白质组数据集，寻找激酶和癌症相关通路活性与silmitasertib疗效之间的相关性，发现silmitasertib抗肿瘤疗效与RAF1和PAK1-2激酶活性之间呈负相关（分别为R=?0.72，p=0.03；R=?0.59，p=0.09；R=?0.69，p=0.04），后者是MEK驱动MAPK和Akt驱动信号的直接激活因子，负责CRC进展。类似观察适用于EGFR和p38 MAPK（已知在CRC进展和治疗耐药中起作用）（分别为R=?0.65，p=0.06和R=?0.68，p=0.044）。此外，研究人员还观察到基线PI3K-Akt和mTOR信号（分别为R=?0.66，p=0.055和R=?0.68，p=0.044）与silmitasertib抗肿瘤活性负相关。这些观察促使研究人员研究MAPK和PI3K-Akt-mTOR信号对silmitasertib疗效的影响。使用western blot分析，研究人员评估了ERK1/2、Akt和S6蛋白活性作为MAPK和PI3K-Akt-mTOR信号活性的代理指标。基于Akt Ser473磷酸化（已知预测Akt介导信号）评估，研究人员观察到silmitasertib处理后Akt活性显著增加（p=0.04），表明上游Akt信号的代偿性激活。值得注意的是，PIK3CA突变的P31是显示高基线和处理后Akt活性增加的PDOs之一。相反，silmitasertib处理倾向于降低S6活性（Akt-mTOR信号下游效应因子）（p=0.07），除外基线S6活性低的PDOs（P5和P26）和对silmitasertib耐药的PDOs（P36和P117）。尽管其他研究显示silmitasertib抑制PI3K-Akt-mTOR通路并同时上调MAPK通路，但研究人员在mCRC PDO队列中未观察到处理后MAPK上调，因为ERK1/2活性总体上未受处理影响。特别地，研究人员观察到KRAS突变的P31和P117处理后高ERK1/2活性，但KRAS突变的P15则不然。相反，silmitasertib敏感性与S6活性降低呈正相关（虽非显著）（R=0.62，p=0.073），与ERK1/2活性降低相关性较小（R=0.47，p=0.20），表明抑制Akt-mTOR及较小程度抑制MAPK信号的能力可能有助于治疗敏感性。总之，数据表明mCRC细胞在CKII阻断下维持Akt-mTOR和MAPK信号活性的能力可能是silmitasertib耐药的潜在决定因素。

联合MEK抑制和silmitasertib介导的CKII阻断对MAPK和Akt-mTOR信号抑制产生加性效应：鉴于silmitasertib疗效与Akt-mTOR和MAPK信号之间的联系，研究人员假设将silmitasertib介导的CKII抑制与Akt-mTOR或MAPK信号抑制联合可增强mCRC PDOs的抗肿瘤活性。研究人员进行了CKII阻断与everolimus（抑制mTOR通路）、ZSTK-474（pan-class I PI3K抑制剂，对mTOR亲和力低）或trametinib（阻断MAPK信号）联合的药物筛选。在PDOs中，共处理抗癌活性显著强于各自单药处理，表明药物间加性和/或协同相互作用。使用SynergyFinder 3.0计算Overall Synergy评分（Bliss、HSA、ZIP和Loewe模型），发现大多数PDOs中所有三种测试组合总体为加性相互作用，部分组合根据应用模型显示协同活性。Bliss模型是最常用模型之一，推荐用于评估两种互不排斥药物（即靶向不同信号通路）之间的相互作用。多数silmitasertib/trametinib浓度组合为加性（81个中54个），81个中26个为协同，单一组合为拮抗（P26；silmitasertib 3 μM和trametinib 10 nM时Bliss评分?10.7）。在PDO水平，平均Bliss协同评分在九个系中五个为加性（?10<评分≤10），其余四个（P5、P15、P46和P117）为协同，表明PDOs间相互作用从加性到协同不等。相反，everolimus（81个中5个拮抗；20个协同）和ZSTK-474（108个中9个；29个协同）拮抗更频繁。研究人员然后评估silmitasertib联合trametinib或ZSTK-474对正常结肠PDO活力的影响。Trametinib单药及与silmitasertib联合导致正常结肠PDO活力无或仅轻度降低，而ZSTK-474导致活力严重降低。Everolimus未在此背景下进一步研究，因为所用浓度超过临床剂量。结合everolimus和ZSTK-474在个别PDOs中观察到的更频繁拮抗以及trametinib实现的优越协同-拮抗比，这些发现支持trametinib作为首选联合伙伴。因此研究人员研究了silmitasertib和trametinib加性至协同相互作用的分子后果。反映silmitasertib的观察，研究人员注意到trametinib处理后残余活力与基线PI3K-Akt-mTOR信号正相关，表明基线通路活性高的PDOs对药物敏感性较低。另一方面，silmitasertib与trametinib联合导致CKII信号较单药进一步显著降低（与silmitasertib和trametinib相比，Benjamini-Hochberg校正p=0.0065和p=0.015）。此外，联合较任一单药更多降低mTORC1-S6信号活性（通过S6活性评估），并较对照和silmitasertib单药降低RAPTOR（参与CRC进展的必需mTORC1辅因子）表达，进一步突出联合的益处。MAPK通路观察到类似效果，联合处理后ERK1/2活性显著降低（校正p=0.033），trametinib是该效应的驱动因素（校正p=0.0098）。值得注意的是，联合比silmitasertib单药更有效降低ERK1/2活性（校正p=0.0098）。另一方面，多重比较校正后Akt活性未检测到单向差异。研究人员还注意到PARP切割（即凋亡诱导）较对照（校正p=0.0098）和silmitasertib单药增加。为量化trametinib对联合效应的特异性贡献，通过比较silmitasertib单药和共处理条件计算蛋白质表达、信号活性和细胞活力的百分比变化。值得注意的是，BRAF和KRAS突变PDOs组在共处理后经历更大的trametinib介导的MAPK和PI3K-Akt-mTOR信号降低（分别为p<0.05和p=0.08）。Trametinib介导的共处理疗效增加与PARP切割相应增加呈正相关（虽非显著）（R=0.57，p=0.11）。为证实这些发现，研究人员在代表性PDO子集（包括最敏感P26、P29和最耐药P31、P117四个系）中通过量化caspase-3/7活性独立验证凋亡诱导，显示两种药物共处理显著升高caspase-3/7活性水平。与PARP切割数据一致，最显著的凋亡反应在P26系中观察到。相反，正常结肠PDOs在任何处理条件下caspase-3/7活性均无显著变化。最后，为进一步证明所提药物联合在mCRC PDOs中的抗癌疗效，研究人员将分析扩展到来自独立mCRC患者队列肝转移的六个额外PDO系。Silmitasertib和trametinib共处理降低所有六个外部mCRC PDO系的细胞活力。六个系中，联合较silmitasertib（平均差?26.7%，校正p=0.007）和trametinib（?20.5%，校正p=0.004）单药更多降低活力。附加益处各系间不同；这种异质性模式与主要PDO队列中观察到的两药主要加性相互作用一致。总之，这些数据表明trametinib驱动的MAPK和Akt-mTOR信号抑制与silmitasertib介导的CKII阻断协同增强mCRC PDOs的抗癌疗效。

Silmitasertib和trametinib共处理降低活性β-catenin丰度和CRC干细胞池：鉴于β-catenin/Wnt信号在CRC维持和进展中的既定作用以及CKII对该通路的调节作用，研究人员研究了共处理对该信号级联的影响。有趣的是，两药间最强的联合效应在基础Wnt活性最高的PDOs中观察到（R=0.74，p=0.021）。鉴于β-catenin是钙黏蛋白复合物的核心组分且其稳定对Wnt信号激活至关重要，研究人员通过western blot评估活性β-catenin异构体丰度。分析显示silmitasertib处理及其与trametinib联合后活性β-catenin水平显著降低（中位数?0.30和?0.44；Benjamini-Hochberg校正p=0.020和p=0.029），而trametinib单药无显著效果。β-catenin在联合下倾向于比任一单药活性更低（与silmitasertib中位数差?0.10，与trametinib中位数差?0.16）；然而，多重比较校正后这些差异未达统计学显著性（均校正p=0.068），与两药间加性而非协同相互作用一致。CRC细胞中CD44和CD133共表达被提出标记CRC干细胞（CSCs）池，Wnt/β-catenin通路在该群体中过度激活。事实上，Wnt通路的药理抑制降低CD133和CD44表达并抑制CD44+CD133+CRC细胞的肿瘤起始特性。此外，CD44被证明对经典Wnt信号激活至关重要。因此，研究人员研究这些标志物的表达以监测治疗对CSCs的影响。结果显示共处理较对照和任一单药显著降低CD44+细胞池，进一步表明联合处理后Wnt/β-catenin通路活性降低。检查对双阳性群体的影响时，研究人员观察到silmitasertib及其与trametinib联合均显著降低CD44+CD133+癌症干细胞池（中位数?10.28和?9.17；Benjamini-Hochberg校正p=0.0098和p=0.033），而trametinib单药无显著效果。同时，CD44?CD133?双阴性群体在silmitasertib和联合下显著增加（中位数+5.74和+13.03；均校正p=0.0065），trametinib单药下较小程度增加（中位数+1.42；校正p=0.015），表明向干细胞样区室外的转变。然而，如预期，队列中观察到异质性结果。最后，研究人员在部分PDOs中对Wnt靶基因和干细胞标志物LGR5、OLFM4和AXIN2进行qPCR分析，结果显示silmitasertib/trametinib联合在大多数测试PDOs中降低或阻止AXIN2、LGR5和OLFM4上调。这些发现与联合处理后活性β-catenin异构体丰度降低一致，共同支持联合CKII和MEK抑制减弱Wnt通路活性并降低CRC干细胞池的结论。总之，这些发现表明共处理减弱Wnt信号并降低mCRC PDOs中的CSC区室。

讨论部分总结：尽管过去几十年mCRC患者预后显著改善，但耐药性仍是重大临床挑战，凸显了对新型治疗策略的需求。PDOs已成为药物发现的最佳平台，蛋白质基因组学研究扩展了研究人员解析癌症脆弱性和设计定制治疗策略的能力。本研究旨在通过分析患者扰动的磷酸化蛋白质组网络并使用mCRC PDOs，鉴定mCRC患者新的个性化医学方法。主要发现是CRC组织和PDOs中酪蛋白激酶II活性的一致上调。CKII是一种组成性活跃的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与调节DNA损伤反应和细胞周期进程等通路。通过称为"非癌基因成瘾"的机制，CKII驱动癌症进展和转移，并通过控制药物外流、DNA修复和NF-κB、β-catenin和p53等关键信号通路促进耐药。关于CKII在癌症中作用的日益增多的证据加强了开发特异性抑制剂的努力。Silmitasertib是CKII催化亚基的ATP竞争性抑制剂，已获FDA孤儿药资格认定（首先用于胆管癌）。尽管更选择性CKII抑制剂（如SGC-CK2-1）的开发对silmitasertib的抗癌特异性提出了问题，但两项独立的磷酸化蛋白质组研究在健康和癌细胞系中证明silmitasertib扰动的大多数生物过程归因于直接CKII抑制而非脱靶效应。研究人员发现silmitasertib处理增加PDO队列中的G2/M阻滞，与先前报道的效果一致。值得注意的是，该效应在耐药PDOs中更明显，表明增强的G2/M检查点参与可能是耐药细胞的生存机制而非细胞毒性反应。此外，鉴于CKII在磷酸化DNA损伤和修复通路关键组分中的作用，相关性数据表明基线DNA修复活性高的癌细胞可能对silmitasertib介导的CKII抑制更敏感，但该假设需要进一步实验验证。PI3K-Akt-mTOR信号是CKII过表达胃癌细胞恶性行为所必需的。Silmitasertib已被证明抑制PI3K-mTOR-S6K同时通过多种翻译后和表观遗传机制诱导MAPK信号，共同导致凋亡或methuosis激活。虽然数据表明S6活性降低趋势与PI3K-mTOR-S6K通路抑制一致，但研究人员未观察到MAPK活性相应增加。然而，研究人员观察到耐药PDOs中silmitasertib处理后ERK1/2活性维持，表明持续MAPK信号可能促进耐药。有趣的是，研究人员观察到silmitasertib处理后ERK1/2活性维持在接受过新辅助化疗的KRAS突变PDOs（P31、P117）中尤为明显，而在未治疗的P15中则不然，表明治疗史可能影响MAPK信号重编程。然而，鉴于样本量有限，该观察需要进一步研究。总之，通过整合磷酸化蛋白质组数据与分子研究和药物治疗结果，本研究表明silmitasertib疗效与MAPK和Akt-mTOR-S6信号的调节相关。一致地，silmitasertib与MAPK（如trametinib）或PI3K-Akt-mTOR（如ZSTK-474）抑制联合导致主要加性药物相互作用（部分PDOs中协同），显著增强抗癌疗效。重要的是，研究人员发现silmitasertib/trametinib联合对正常结肠PDO活力影响最小，同时降低MAPK和Akt-mTOR-S6信号通路。研究人员还发现高基线PI3K-Akt-mTOR信号与silmitasertib和trametinib单药耐药相关，为联合提供了理论依据。虽然CKII和MEK抑制联合的效果已有描述，但本研究首次报道trametinib与silmitasertib合作进一步降低CKII活性。尽管协同通常是药物联合研究的首选读数，但它既非临床有效联合的必要也非常见特性：事实上，95%的FDA批准晚期癌症联合在无进展生存期上显示加性或低于加性效应。因此，silmitasertib和trametinib之间主要加性（部分PDOs中协同）的相互作用支持该联合的进一步临床前评估。然而，由于部分PDOs中相互作用类型随浓度变化，药物暴露的微小差异可能使其向协同或拮抗转变，需要在临床转化前进行剂量优化研究。APC在CRC中频繁突变，通过β-catenin的异常稳定驱动Wnt信号激活，这对健康成体干细胞和CSCs的干细胞自我更新至关重要。CD44和CD133蛋白已被证明赋予CSC重要的肿瘤起始特征并驱动癌症治疗耐药。研究人员发现silmitasertib和trametinib联合有效降低活性β-catenin丰度并减少CRC干细胞池，这一点很重要，因为trametinib单药已被证明通过Wnt信号激活无意中促进细胞可塑性，进一步强调联合策略的重要性。本研究存在局限性。虽然10个mCRC PDOs队列（其中9个可用于功能实验）通过配对多组学分析进行了广泛表征，并辅以六个额外PDOs的验证面板，但仍需在更大的独立队列中确认。另一个局限性是用于（磷酸化）蛋白质组比较的正常结肠黏膜组织来自无关患者而非同一肿瘤供者的组织，因为肿瘤标本从肝转移手术切除且匹配的正常结肠黏膜不可及。因此，观察到的肿瘤与正常差异部分可能反映患者间异质性而非严格肿瘤特异性改变。患者来源类器官缺乏肿瘤微环境的免疫和基质成分，这可能调节对CKII和MEK抑制的反应，应在免疫健全和共培养系统中评估。最后，silmitasertib/trametinib联合的治疗潜力需要在临床转化前在临床前体内模型中验证。

研究结论翻译：总之，研究人员的磷酸化蛋白质组学引导方法鉴定CKII为mCRC的治疗脆弱性靶点，并为silmitasertib与trametinib联合提供了理论依据。在临床前体内模型和临床环境中的进一步验证对于确立该联合对mCRC患者的全部治疗潜力至关重要。