甘草酸特异性单链抗体在Sf9细胞中的杆状病毒介导表达及功能表征

《Innovations in Acupuncture and Medicine》：Baculovirus-Mediated Expression and Functional Characterization of a Glycyrrhizin-Specific Single-Chain Variable Fragment in Sf9 Cells

　　

背景：甘草酸（GC）是甘草属植物中的主要生物活性皂苷。研究人员以抗GC单克隆抗体2H2为基础构建了GC特异性单链可变区片段（GC-scFv）。为获得用于GC免疫分析的 soluble 重组识别试剂，研究人员利用杆状病毒-昆虫细胞平台表达GC-scFv。方法：可变重链和轻链基因从2H2杂交瘤来源的互补DNA（cDNA）中扩增，并使用(Gly₄Ser)₃连接肽进行组装。该构建体经pET-28a(+)和pCold I转移至pFastBac1Mel中，后者含有蜜蜂蜂毒肽信号序列，用于在Sf9昆虫细胞中分泌表达。GC-scFv通过镍螯合亲和层析回收，并使用间接竞争酶联免疫吸附试验（icELISA）进行表征。校准曲线采用半对数回归分析，每个浓度设三个复孔。结果：抗T7标签Western blot在培养基回收的洗脱液中检测到分子量约29 kDa的GC-scFv。游离GC产生浓度依赖性抑制，半数抑制浓度（IC₅₀）为0.46 μg/mL，半对数校准区间为0.0488–3.125 μg/mL。表观检出限和表观定量限分别定义为10%和20%抑制，分别为54.2和92.8 ng/mL。对甘草次酸3-O-葡萄糖醛酸的交叉反应率为24.47%，对甘草次酸为6.52%，对其余测试化合物均低于0.92%。结论：杆状病毒-Sf9平台产生的GC-scFv对GC具有竞争性结合活性。所回收的试剂及其分析特性为开发含甘草产品的重组抗体免疫分析奠定了基础。

甘草（Licorice）为来源于甘草属（Glycyrrhiza spp.）植物干燥根及根茎的药用草本，主要包括胀果甘草（G. uralensis）、光果甘草（G. glabra）和脹果甘草（G. inflata）。在传统中医学中，甘草被视为"国老"，被纳入大量复方制剂中，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛及调和诸药之功效。其在东亚医学中作为"引经药"的重要地位归因于其增强疗效、降低毒性及改善复方制剂适口性的能力。甘草亦是日本汉方医学的重要组成部分，日本药典将G. uralensis和G. glabra列为法定植物来源，且甘草被纳入日本294种已批准非处方汉方制剂中的214种，使用率高达72.8%。现代药理学研究将甘草的多种生物活性归因于甘草酸（GC），其为根部积累的主要齐墩果烷型三萜皂苷。GC具有抗炎、抗过敏、保肝及抗病毒活性，因此被认为是甘草来源制剂质量控制的关键标志化合物。由于监测活性标志化合物对于确保含GC制剂的质量和一致性至关重要，因此需要灵敏可靠的GC检测和定量分析方法。

目前粗提物和商业制剂中GC的定量分析主要依赖常规物理化学技术，包括高效液相色谱（HPLC）、高效薄层色谱（HPTLC）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）和毛细管电泳（CE）。虽然HPLC具有优异的精密度和重现性，但其样品制备耗时长、运行成本较高、依赖有机溶剂且通量有限，使其不太适合大批量样品的快速现场筛查。紫外（UV）和光电二极管阵列检测器常用于色谱分析，其灵敏度取决于分析物的紫外吸收特性。使用单克隆抗体（mAbs）的酶联免疫吸附试验（ELISA）为测定甘草成分提供了替代方法。然而，基于传统杂交瘤的mAb生产方法存在生产成本高和潜在的批间变异等问题。

重组DNA技术通过开发单链可变区片段（scFv）抗体提供了替代途径。scFv是通过柔性肽连接肽将免疫球蛋白的可变重链（VH）和可变轻链（VL）结构域基因连接而成的抗体片段。该形式在约29 kDa的显著更小的分子结构中保留了负责抗原识别的可变区序列，便于基因操作和重组生产。原核表达系统，特别是大肠杆菌（Escherichia coli），广泛用于scFv生产。常规胞质表达可产生不溶性包涵体，需要变性和体外复性以回收功能性抗体片段。相比之下，真核表达系统，特别是使用来源于草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）卵巢组织的Sf9细胞的昆虫细胞-杆状病毒系统，提供了支持翻译后加工（包括正确的二硫键形成和蛋白质折叠）的细胞环境。这些特性可促进生物活性重组抗体的分泌。

本研究旨在使用Sf9-杆状病毒表达系统生产和表征一种对甘草酸具有特异性的功能性重组scFv抗体。研究人员从杂交瘤细胞系2H2中获取可变区基因，组装为抗GC的scFv（GC-scFv），并整合到昆虫细胞分泌表达构建体中。GC-scFv通过镍螯合亲和层析从培养基中回收。随后建立间接竞争ELISA（icELISA）以评估其竞争性结合活性、分析灵敏度、校准响应及对结构相关化合物的交叉反应性（CR）。该研究为进一步的免疫分析开发及涉及含甘草制剂的质量控制应用提供了重组识别试剂。

在方法学上，研究人员首先从mAb 2H2杂交瘤细胞中提取总RNA并合成第一链cDNA，通过PCR分别扩增免疫球蛋白的VH和VL基因，经pGEM-T Easy载体克隆测序验证后，采用重叠延伸PCR（SOE-PCR）通过(Gly₄Ser)₃连接肽组装scFv。组装后的GC-scFv经BamHI和SalI位点克隆入pET-28a(+)载体，再将含T7标签的GC-scFv盒经NdeI和SalI位点插入pCold I载体，最终将His/T7标签盒经SalI和HindIII位点插入pFBM供体载体中HMSS下游。重组杆粒通过转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞经位点特异性转座产生，经蓝白斑筛选和菌落PCR验证后转染Sf9昆虫细胞，收集初级病毒 stock 并通过噬斑试验和qPCR测定滴度。GC-scFv在Sf9细胞中以MOI为5感染表达72 h，培养上清经镍螯合亲和层析纯化，通过12.5% SDS-PAGE和Western blot分析。以GC-HSA偶联物为包被抗原建立iELISA确定最佳工作稀释度，并建立icELISA评估竞争结合特性、分析灵敏度和交叉反应性。数据分析为描述性统计，各浓度设三个技术复孔，结果以均值±标准差表示。

结果部分，研究人员首先成功构建了杆状病毒供体载体和重组杆状病毒。从mAb 2H2杂交瘤细胞系制备的cDNA中成功扩增了VH和VL结构域基因，经SOE-PCR组装后GC-scFv插入片段为723 bp。组装基因经pET-28a(+)转移至pCold I，菌落PCR筛选获得约1000 bp的扩增产物，Sanger测序确认插入序列及方向。在大肠杆菌BL21(DE3)中的初步表达产生约29 kDa的推定GC-scFv条带，主要存在于不溶性组分中。His/T7标签GC-scFv盒连接入pFBM供体载体HMSS下游，菌落PCR筛选获得约1000 bp条带，DNA测序确认框内插入及序列完整性。将pFBM/GC-scFv供体质粒转化DH10Bac细胞，经蓝白斑筛选和菌落PCR评估表达盒插入杆粒基因组，产生预期的约3.3 kb扩增产物。重组杆粒DNA转染Sf9细胞后72–96 h内出现细胞肿胀、裂解和生长停止，符合杆状病毒感染特征。扩增后病毒 stock 经qPCR测定估算滴度约为5×10⁸ PFU/mL，用于蛋白表达。

其次，研究人员完成了GC-scFv的表达与纯化。Sf9细胞被携带GC-scFv表达盒（位于多角体启动子下游及HMSS下游）的重组杆状病毒感染。GC-scFv通过镍螯合亲和层析从澄清培养上清中回收。还原性SDS-PAGE后，使用HRP偶联抗T7标签抗体对洗脱组分进行Western blot分析，检测到约29 kDa的单一条免疫反应条带，与含多聚组氨酸和T7标签的GC-scFv预期大小一致。100 mL培养物提供约2.5 mL洗脱液，以PBST 1:10稀释后作为竞争试验的工作抗体试剂，对应约25 mL试剂，足以满足500孔（每孔50 μL）使用。

第三，研究人员对重组GC-scFv进行了表征。通过icELISA评估回收的GC-scFv制剂的生物活性和分析特性。试验以GC-HSA（5.0 μg/mL）为固相包被抗原，GC-scFv为识别试剂。游离GC产生浓度依赖性抑制，在对数浓度轴上呈S形浓度-响应曲线。在0.0488–3.125 μg/mL中心校准区间进行半对数回归，得A/A₀ = ?0.186 ln(x) + 0.3575（R² = 0.9867），IC₅₀为0.46 μg/mL，表观LOD（IC₁₀）和表观LOQ（IC₂₀）分别为54.2和92.8 ng/mL。为评估分析特异性，研究人员对结构相关化合物及甘草和其他草药的代表性成分（包括三萜皂苷、皂苷元和黄酮类）进行了CR评估。以GC为100%参考，甘草次酸3-O-葡萄糖醛酸的IC₅₀为1.88 μg/mL，CR为24.47%；苷元GA的IC₅₀为7.05 μg/mL，CR为6.52%；人参皂苷Rg1、Rb1、Re、甘草苷、甘草素和甘草皂苷H2在50.0 μg/mL时均显示<50%抑制，对应CR值低于0.92%。

讨论部分，研究人员指出，草药材料和提取物中生物活性标志物的定量质量控制对于评估产品一致性至关重要。GC作为甘草属植物中主要的药理活性皂苷，可作为含甘草制剂标准化的化学标志物。mAbs为免疫分析提供灵敏和选择性的识别试剂，而重组抗体片段提供了可从已表征表达构建体生产的基因定义试剂。其较小的分子尺寸和模块化VH-连接肽-VL结构也便于基因操作和进一步的分析开发。本研究构建了来源于mAb 2H2的GC-scFv，使用杆状病毒-Sf9系统表达，并从培养基中回收了具有GC竞争性结合活性的产物。重组抗体生产的一个主要挑战是获得保留抗原结合活性的可溶性蛋白。大肠杆菌BL21(DE3)常规胞质表达可因还原性胞质环境限制免疫球蛋白结构域折叠过程中氧化二硫键形成而有利于包涵体形成。功能性回收因此可能需要变性和体外复性，可溶性聚集体也可能使活性scFv的回收复杂化。与这一挑战一致，研究人员最初的GC-scFv在BL21(DE3)中的表达产生的主要是不溶性重组蛋白。周质表达提供了支持二硫键形成的氧化环境，功能性scFv生产取决于成功穿越内膜转运及随后在周质中的折叠。高表达水平可使细菌输出机器饱和，导致前体积累和正确加工的重组蛋白回收减少。信号肽的比较表明，其选择影响scFv转运、细菌生长和活性周质scFv的回收。尽管大肠杆菌可实现高细胞密度和高总重组蛋白产量，但功能性活性scFv的量还取决于成功的加工和折叠。周质蛋白在细胞收获后通过选择性提取（如渗透休克法）回收，在纯化和功能分析前增加了回收步骤。杆状病毒-Sf9系统提供了真核分泌途径，其中信号肽将新生重组蛋白引导至内质网，支持二硫键形成和折叠后分泌至培养基中。研究人员的优先目标是回收可溶性、功能性活性GC-scFv用于免疫分析表征。在含HMSS的pFBM构建体中，重组蛋白释放至培养基中，允许澄清上清直接进行亲和纯化而无需细胞裂解或周质提取。针对小分子靶标的功能性scFv此前已使用Sf9细胞回收，包括抗白花丹醌scFv和从感染细胞培养上清中回收的抗地高辛scFv。这些早期研究结果连同直接胞外回收途径，促成了研究人员选择杆状病毒-Sf9系统。在本研究中，GC-scFv在一步镍螯合亲和层析后无需变性或体外复性即保留了竞争性结合活性。由于亲和洗脱液含有共洗脱蛋白，无法确定可靠的GC-scFv比质量产量（毫克/升），因此无法将总蛋白浓度特异性归因于GC-scFv。因此，研究人员使用回收的洗脱液体积和工作稀释度来描述每次表达运行可获得的功能性试剂用量。100 mL Sf9培养物提供约2.5 mL洗脱液，经iELISA选择1:10稀释以在450 nm处提供约1.0的吸光度，产生约25 mL工作抗体试剂。以每孔50 μL计，该体积足以满足约500孔使用，相当于以每板60孔计八个分析板。icELISA表征显示GC-scFv保留了竞争性结合活性，IC₅₀为0.46 μg/mL，半对数校准区间为0.0488–3.125 μg/mL，表观LOD和表观LOQ分别为54.2和92.8 ng/mL。表观LOD约为亲本mAb 2H2分析报告LOD（8.99 ng/mL）的六倍。因此，亲本抗体分析在更低浓度下检测GC，而重组GC-scFv分析在<1 μg/mL浓度下保留了抑制响应。其他抗体在转换为重组抗体形式时伴随的分析响应变化也有报道。校准区间与甘草经适当稀释后可获得的GC浓度兼容。栽培胀果甘草根中报告的GC含量为0.46–4.67%（w/w）。作为示例性计算，50 mg材料完全甲醇提取、提取物以1 mL甲醇复溶、以水20倍稀释将给出11.5–116.75 μg/mL GC，再50倍稀释将在与抗体混合前给出0.230–2.335 μg/mL，处于半对数校准区间内。该计算为后续应用于甘草提取物确定了实用稀释策略。稀释还降低了引入分析中的共提取成分浓度。CR分析显示，GC-scFv和亲本mAb 2H2均对GC显示最高竞争反应性，其次为甘草次酸3-O-葡萄糖醛酸，然后是GA。单葡萄糖醛酸苷和GA对GC-scFv的CR值分别为24.47%和6.52%，而mAb 2H2的已发表值分别为3.22%和0.42%。反应性的共同顺序表明重组单链形式保留了对GC的偏好。CR的数值差异区分了各自分析条件下的这些类似物。三种结构提供了糖基化与竞争性识别的逐步比较。GC在其齐墩果烷型三萜骨架C-3位携带两个葡萄糖醛酸残基。去除远端残基得到甘草次酸3-O-葡萄糖醛酸，其竞争反应性降低。去除两个葡萄糖醛酸残基得到苷元GA，其特征是反应性进一步降低。GC、单葡萄糖醛酸苷和GA系列中反应性的渐进性降低表明识别区域从近端葡萄糖醛酸残基延伸至苷元C-3区域，远端葡萄糖醛酸残基作为识别的焦点。单葡萄糖醛酸苷反应性低于GC突显了远端葡萄糖醛酸残基的主导贡献，而GA观察到的进一步降低表明近端葡萄糖醛酸/C-3区域的额外贡献。糖基化变化也改变分子极性、疏水性和蛋白质相互作用特性。总之，类似物系列支持C-3连接的葡萄糖醛酸区域在竞争性识别中的重要性。尽管亲本mAb 2H2是使用高碘酸氧化GC偶联物产生的，但mAb 2H2和GC-scFv均对GA和单葡萄糖醛酸苷显示较低的CR。这一发现表明识别依赖于完整GC的结构特征，而较小类似物未能再现这些特征，尽管免疫原制备过程中引入了化学修饰。一种可能的解释是高碘酸氧化修饰远端葡萄糖醛酸残基中的邻二醇，同时保留足够的羧酸盐和含氧官能团或整体三维排列以维持结合所需的关键接触。偶联几何构型、半抗原密度和载体上的抗原呈递也可能有利于针对天然GC架构的B细胞应答的选择。直接表位作图和偶联物对照实验将有助于区分这些推测的贡献。降低的CR也可能反映杂交瘤筛选过程中2H2克隆的选择。最后，竞争性icELISA反映了亲和力、表位可及性、分析物呈递和分析相分配的联合效应。正交动力学和生物物理测量可进一步解析这些对溶液中识别的贡献。甘草皂苷H2的低CR提供了额外的结构比较。这种甘草来源皂苷保留了二葡萄糖醛酸取代基，显示CR<0.92%。结合GC、单葡萄糖醛酸苷和GA比较的结果，甘草皂苷H2的低CR表明识别取决于葡萄糖醛酸区域在整体三萜结构中的呈现方式。GC-scFv对测试的达玛烷型皂苷人参皂苷Rg1、Rb1和Re以及黄酮类甘草苷和甘草素也显示CR<0.92%。因此，结果支持在测试化合物面板中对GC的优先识别，并为进一步分析开发选择基质和稀释条件提供了基础。交叉反应物的分析贡献取决于其丰度以及CR。GC是甘草根中的主要皂苷，在栽培G. uralensis样品中报告含量为0.46–4.67%（w/w）。单葡萄糖醛酸苷被描述为在天然植物材料中不常见，一项甘草总提取物研究报告了不可检测的单葡萄糖醛酸苷信号。这些观察支持单葡萄糖醛酸苷在此类未加工甘草材料中的较低贡献。加工可改变这一平衡，因为烘焙后已观察到GA和单葡萄糖醛酸苷信号增加。对于加工制剂，可使用各类似物的浓度及其CR值（单葡萄糖醛酸苷24.47%，GA 6.52%）评估其贡献。回收率、稀释平行性和批间精密度是将GC-scFv分析扩展至甘草提取物的下一性能指标。

结论部分翻译：本研究构建了来源于mAb 2H2的功能性GC-scFv，并使用杆状病毒-Sf9系统进行了表达。含HMSS的构建体产生了可溶性GC-scFv，通过镍螯合亲和层析从培养基中回收，并保留了对GC的竞争性结合活性。icELISA显示IC₅₀为0.46 μg/mL，对甘草次酸3-O-葡萄糖醛酸的CR值为24.47%，对GA为6.52%，对其余测试化合物<0.92%。100 mL表达培养物提供了约500个分析孔的工作试剂。该重组识别试剂及其校准特性为进一步开发GC免疫分析及其在含甘草产品质量评估中的应用提供了基础。