组织储存对生物分析数据及活组织科学的影响

《Current Oncology Reports》：Impact of Tissue Storage on Bioanalytical Data and Live Tissue Science

　　

目的综述：精准肿瘤学日益依赖跨基因组学、转录组学、蛋白质组学、表观遗传学及活细胞应用的肿瘤组织准确分子与功能表征。本综述评估常用组织保存方法，包括福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）、新鲜、速冻及冷冻保存组织，对下游分析保真度和转化效用的影响。近期发现：近期比较研究表明，FFPE对组织病理学及少数成熟分子检测仍然有效，但会引入核酸片段化、交联、脱氨基伪影、蛋白质修饰及细胞活力丧失。这些效应可降低测序效率、改变定量分子测量，并限制需要完整蛋白质或活细胞的应用。相比之下，速冻和冷冻保存组织通常提供更高的分子保真度，而控速冷冻保存额外保留活力细胞群体，用于单细胞分析、类器官开发、功能性精准医学、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）扩增及嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）制造。新兴证据亦支持使用冷冻保存的活肿瘤生物样本库进行纵向和功能检测。总结：没有单一保存方法对所有应用均为最优。FFPE仍是常规病理学所必需，速冻适合高保真分子谱分析，控速冷冻保存对分子和活细胞应用提供最广泛兼容性。将组织保存与预期诊断、分子、功能和治疗用途对齐的前瞻性生物样本策略可提高精准肿瘤学的可靠性和临床效用。

引言部分指出，精准肿瘤学日益依赖肿瘤组织的分子表征以指导诊断、预后、治疗选择和疾病监测。高通量测序、转录组谱分析、蛋白质组学和功能细胞检测现允许跨多个生物学层面评估肿瘤，从而更全面理解肿瘤异质性和治疗脆弱性。然而，这些下游分析的准确性在很大程度上取决于生物样本在分子检测前收集、保存和处理的方法。福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织仍是临床病理学的标准保存方法，因其提供优异的组织形态学保存、长期室温稳定性和与常规诊断工作流程的兼容性。尽管有这些优势，福尔马林固定引入化学交联、核酸片段化、脱氨基伪影和蛋白质修饰，可能损害分子保真度。虽然许多分析工作流程已优化以适应FFPE来源材料，但这些调整通常需要缩短扩增子、增加扩增、计算伪影校正或选择性转录本靶向，每种均可能引入额外技术偏倚。重要的是，许多FFPE优化策略以匹配的新鲜或冷冻组织为基准，后者继续作为分子保真度的参考标准。保存诱导的分子改变后果因生物系统而异。DNA测序应用通常显示FFPE与匹配新鲜或冷冻组织之间中度不一致，而RNA测序、甲基化谱分析和蛋白质组分析对固定相关降解和扭曲表现出逐渐更大的易感性。这些限制在活细胞应用中更为显著，包括类器官开发、离体药物筛选、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）扩增和CAR-T制造，其中细胞活力和功能的保存至关重要。相比之下，新鲜组织、速冻和冷冻保存通常通过最小化化学修饰和限制酶促降解更有效地保留分子和细胞完整性。然而，这些方法引入与储存、运输、基础设施和工作流程整合相关的后勤挑战。随着精准肿瘤学日益将多组学和功能检测纳入临床决策，平衡实际可行性与生物保真度已成为生物样本管理的关键考虑。重要的是，保存相关效应高度依赖背景，并可能因组织类型、肿瘤细胞密度、缺血间隔、固定持续时间、储存条件、提取方法、测序平台和文库制备工作流程而显著变化。基质组成、坏死、核酸丰度和分析前处理的差异可显著影响下游分子性能，独立于保存方法本身。此外，提取化学、计算伪影校正和优化文库制备策略的进展继续改善FFPE来源材料在选定应用中的分析效用。因此，跨研究观察到的保存相关扭曲程度应在测定设计、组织处理方案和预期下游临床或研究应用的更广泛背景下解释。本综述评估组织保存方法对DNA测序、甲基化谱分析、转录组学、蛋白质组学和活组织应用的影响。特别强调保存相关伪影如何影响现代精准医学中的下游分析准确性、功能解释和转化效用。文献通过PubMed检索确定，使用包括FFPE、新鲜冷冻、冷冻保存、DNA测序、RNA测序、蛋白质组学、DNA甲基化、类器官、TIL和CAR-T等术语组合。优先考虑过去六年内发表的评估临床相关人类生物样本中匹配保存方法的原创和直接比较研究。必要时纳入早期开创性出版物以提供历史背景或描述基础方法学。相关文章的参考文献列表亦被筛选以识别主要检索未捕获的额外研究。

组织学与免疫组织化学部分指出，组织学评估和免疫组织化学（IHC）仍是癌症诊断和生物标志物评估的基础工具。FFPE组织在临床病理学中广泛受青睐，因为福尔马林固定极好地保存组织结构并允许室温长期储存。然而，形态学保存不一定等同于分子保真度保存。大量研究表明，福尔马林固定可通过蛋白质交联和表位掩蔽降低抗原可检测性，从而影响免疫组织化学分析的灵敏度和可重复性。与匹配FFPE组织相比，新鲜冷冻样本对多个临床相关蛋白质标志物一致显示更强和更可靠的染色。即使在抗原修复程序后，FFPE组织中CD31、CD68、HER2、p53和PD-L1等标志物的抗原可检测性降低已有报道。重要的是，这些降低不一定反映底层蛋白质的缺失，而是固定诱导构象变化继发的抗体可及性降低。多项研究进一步表明，FFPE组织中抗原降解可能随时间恶化，延长储存导致染色灵敏度下降和临床可操作生物标志物假阴性率增加。福尔马林暴露前延迟固定同样与激素受体和HER2检测降低相关，在某些情况下改变肿瘤分类并可能影响治疗资格。例如，评估PD-L1抗体的研究显示灵敏度从冷冻组织的100%降至FFPE处理后的67%和33%，取决于抗体克隆选择。尽管抗原修复技术可部分改善信号恢复，但恢复不完全且高度依赖靶蛋白和修复方案。因此，FFPE来源的IHC结果可能跨生物标志物表现可变灵敏度，为诊断解释引入额外分析变异性。相比之下，新鲜冷冻和冷冻保存组织通常维持更接近天然生物状态的蛋白质构象，改善表位可及性和分子保真度。然而，这些方法与更大的后勤复杂性相关，且通常提供相对FFPE较差形态学保存。因此，组织病理学中的组织保存代表结构稳定性与分子准确性之间的权衡，最佳方法取决于预期下游应用。

下一代DNA测序部分指出，下一代测序（NGS）已成为精准肿瘤学的核心，能够快速识别体细胞突变、拷贝数改变和临床可操作基因组变异。由于测序准确性严重依赖核酸质量，组织保存方法是下游分析性能的主要决定因素。新鲜冷冻和冷冻保存组织通常比FFPE组织更有效保留DNA完整性，而福尔马林固定引入片段化、交联和化学修饰，可损害测序保真度。跨多种肿瘤类型和测序平台，FFPE来源DNA一致显示相对匹配速冻（FF）或冷冻保存组织片段长度缩短、扩增效率降低、文库复杂性降低和测序伪影增加。这些效应在需要高分子保真度的应用中尤为问题，包括全基因组测序（WGS）、低频变异检测和长读长测序方法。尽管优化提取方案和生物信息学校正方法可部分缓解这些限制，保存相关伪影继续导致跨平台不一致变异调用和可重复性降低。为比较保存方法，本节综合DNA测序性能主要决定因素的证据，包括DNA产量和片段完整性、测序伪影、变异一致性和临床工作流程影响。这些参数共同定义测序数据的分析质量并最终影响基因组谱分析的临床效用。DNA产量和片段完整性方面，从保存肿瘤组织获得的DNA质量是NGS性能的主要决定因素。保存相关片段化、提取产量降低和扩增效率受损可显著影响文库制备、测序准确性和下游变异检测。跨多项研究，FF和冷冻保存组织在DNA完整性、片段长度和测序可行性方面一致优于FFPE组织。FFPE来源DNA的主要限制之一是福尔马林固定和长期储存引起的广泛片段化。与FF和冷冻保存组织相比，FFPE样本一致产生较短DNA片段，减少可用于扩增和文库构建的可行模板数量。在直接比较中，FFPE来源DNA片段插入大小平均为391–444 bp，而匹配FF和冷冻保存样本产生显著更长片段插入大小，范围约477–645 bp。在一些冷冻保存样本中，大于50,000 bp的DNA片段被保留，支持与长读长测序方法和WGS应用的兼容性。FFPE中较短片段长度额外增加嵌合读数和错误基因组映射的可能性，进一步损害测序保真度。这些结构差异对PCR扩增效率和文库制备成功有重要下游影响。在评估EGFR和KRAS外显子靶向扩增的研究中，FF样本实现几乎普遍PCR成功，而匹配FFPE样本显示扩增成功率接近50%。福尔马林固定剂类型亦影响性能，因为中性缓冲福尔马林优于简单福尔马林，可能由于固定期间改善的pH稳定性。将扩增子大小从295 bp缩短至235 bp大幅改善FFPE来源DNA的扩增成功，支持保存相关片段化是FFPE组织测序失败主要贡献者的结论。因为PCR扩增在文库制备期间以指数方式发生，即使扩增效率适度降低也可大幅降低测序深度和覆盖均匀性。这些效应在低输入临床样本如细针活检中尤为问题，其中有限起始材料已限制测序性能。在临床研究中，新鲜冷冻细针活检实现99%成功率获得足够DNA输入用于WGS，尽管肿瘤纯度低至20%。定量比较同样显示保存方法之间测序产量的实质差异。Bhagwate等报道FF组织产生约五倍长DNA片段并产生比匹配FFPE样本约80%更大DNA产量。同样，Oba等证明即使优化FFPE提取工作流程产生显著较低文库产量和测序覆盖度比FF来源DNA。使用等效30 ng DNA输入，FF组织产生约十倍更大文库产量和显著更高平均覆盖度比FFPE组织。冷冻保存组织亦显示相对FFPE显著更大DNA产量和片段保存，进一步支持其用于需要高分子完整性应用的效用。尽管专门提取方法和较短扩增子策略可部分缓解这些挑战，此类调整增加分析复杂性并可能引入额外偏倚。相比之下，FF和冷冻保存组织保留足够DNA完整性以支持稳健文库制备、更深测序覆盖度和更广泛兼容全基因组和长读长测序应用，且起始材料更少，从而有利于小活检。测序伪影和变异不一致性方面，除降低DNA产量和片段完整性外，FFPE保存引入可显著影响测序准确性和下游变异解释的化学改变。福尔马林固定与胞嘧啶脱氨基、氧化损伤和核苷酸交联相关，所有这些均贡献于FF和冷冻保存组织中 substantially 较少见的测序伪影。这些保存诱导改变可产生假变异调用、扭曲变异等位基因频率并降低匹配样本间一致性。FFPE相关伪影最充分表征之一的是胞嘧啶脱氨基，其在测序分析期间贡献特征性C > T/G > A替换模式。比较匹配FFPE和FF样本的研究一致显示FFPE来源DNA中伪影负担增加，即使整体映射统计在保存方法间看似相似。在使用乳腺癌细胞系HCC1395的直接比较中，映射读数和非冗余读数频率在FFPE和新鲜样本间可比；然而，变异调用期间精确度和召回率在FFPE来源DNA中大幅降低，因为固定相关核苷酸伪影。重要的是，一些FFPE相关伪影超过常用于生物信息学过滤的变异等位基因频率（VAF）阈值，复杂化区分真实低频体细胞突变与保存诱导测序噪声的努力。早期工作证明FFPE来源DNA中伪影频率接近每500碱基对一次序列改变，提供福尔马林固定可引入分子检测可检测序列变化的首批证据。后续研究证明FFPE与匹配FF肿瘤样本之间临床有意义不一致，包括KRAS和TP53变异检测差异。在转移性结直肠癌中，匹配FFPE和FF样本直接比较揭示KRAS突变调用大于27%不一致，包括假野生型分类和特定突变身份差异。同样，评估结直肠肿瘤靶向基因面板的研究识别众多FFPE样本独特变异，报道TP53一致性率低于75%；然而，一旦从方程中移除基线阴性，重新计算的一致性率为55%。在黑色素瘤全外显子组测序研究中，FFPE样本显示广泛文库制备失败、数千可检测变异丢失和一致性率低至43%，主要归因于低DNA质量和固定相关伪影负担。大规模测序研究进一步支持FFPE处理大幅增加基因组扭曲的结论。在跨44家医院收集的2,520 FF样本多中心分析中，仅0.11%样本显示指示DNA损伤的严重全局不平衡值评分。相比之下，FFPE丰富数据库如癌症基因组图谱和1,000基因组计划的回顾性分析分别识别41%和73%样本中严重不平衡评分。这些发现强调福尔马林固定跨大型测序队列对基因组完整性的广泛影响。FFPE相关伪影亦影响定量基因组指标如肿瘤突变负荷（TMB）和突变等位基因异质性评分。在配对胃食管肿瘤全外显子组测序分析中，FFPE标本显示显著更高突变等位基因异质性评分比匹配新鲜冷冻组织，提示固定相关伪影可能影响基因组复杂性定量测量。这些发现在精准肿瘤学中尤为相关，其中TMB日益用于指导免疫治疗资格和治疗分层。尽管提取方案、较短扩增子策略、DNA修复方法和计算过滤的进展已大幅改善测序性能，固定诱导核苷酸改变继续降低变异一致性并复杂化临床可操作突变解释。相比之下，新鲜冷冻和冷冻保存组织一致显示更高基因组保真度和更低伪影负担，支持更准确检测体细胞变异并增加下游临床解释信心。这些差异随着基因组谱分析在生物标志物指导治疗选择中承担更大角色而日益重要，强调生物样本质量与分子诊断临床效用之间的密切关系。保存的临床后果方面，组织保存方法引入的技术限制对临床测序工作流程和患者护理有直接后果。降低的DNA完整性、失败的文库制备、低测序产量和保存相关伪影可增加测定失败率、延长周转时间并延迟生物标志物指导治疗启动，最终可能贡献于次优治疗决策。FFPE来源DNA经常需要在文库制备期间额外优化，因为片段化和降低扩增效率损害测序性能。失败扩增反应、不足文库复杂性、不均匀覆盖度和低读数深度通常需要重复提取、重复测序或使用较短扩增子重新设计测定参数。这些额外故障排除步骤增加工作流程复杂性并降低可重复性，特别是在低输入临床标本如细针活检中。保存相关测序失败的影响在临床肿瘤学设置中尤为重要，其中治疗决策日益依赖及时分子谱分析。即使在高度优化测序程序中，全面基因组检测的周转时间可能接近两周。近期临床研究报告肺癌分子谱分析平均周转时间13.9天，尽管大量工作流程优化努力。在较少优化临床环境中，保存相关文库失败和重复检测可能进一步延长这些时间线。这些延迟对患者管理有有意义影响。多项研究证明相当比例患者在全面分子谱分析可用前启动全身治疗，降低一线治疗决策可由肿瘤完整基因组景观告知的可能性。在晚期非小细胞肺癌中，约24%患者在收到基因组谱分析结果前启动治疗。肿瘤学工作流程更广泛分析提示高达50%患者可能在没有完整生物标志物检测情况下开始一线治疗，一些肿瘤类型比率高达83%。延迟分子结果因此可能贡献于次优治疗选择、错过靶向治疗资格和精准肿瘤学策略实施减少。重要的是，许多这些工作流程限制与FFPE来源DNA降低的分子保真度密切相关。较低测序产量、增加伪影负担和较高测定失败率共同增加重复处理可能性和延迟报告。相比之下，FF和冷冻保存组织通常提供更高质量DNA，具有更大扩增成功、更可靠文库制备和改善测序一致性，从而支持更高效下游临床工作流程。这些发现提示保存策略不仅影响测序准确性，还影响精准医学在临床护理中的实际实施。随着分子谱分析日益成为治疗决策核心，减少保存相关测序失败可改善分析可靠性和患者特异性治疗选择的及时性。

下一代测序DNA甲基化部分指出，DNA甲基化谱分析对肿瘤分类、预后评估、生物标志物发现和新兴精准肿瘤学应用日益重要，使保存相关分析偏倚成为研究和临床检测的重要考虑。准确甲基化分析取决于组织处理和核酸提取期间天然胞嘧啶甲基化模式的保存。然而，保存诱导DNA损伤和化学修饰可改变甲基化测量并降低表观基因组解释信心。多项比较FFPE和FF组织的研究证明福尔马林固定可通过DNA片段化、交联、降低模板质量和下游分析工作流程期间引入的扩增偏倚降低甲基化测量准确性。尽管全局甲基化模式在保存方法间通常保持广泛相关，FFPE样本一致显示降低DNA质量和特定CpG位点甲基化测量变异性增加。结直肠癌标本比较分析证明FFPE来源DNA可显示相对匹配FF组织甲基化测量变异性增加，这些差异幅度取决于靶位点和DNA提取方法学。在卵巢和胰腺癌研究中观察到类似发现，FFPE样本显示降低技术质量评分、更高探针失败率和增加偏离匹配新鲜组织甲基化谱。在一项卵巢癌甲基化研究中，87.4%失败探针来源于FFPE来源组织，而仅2.72%失败探针与FF样本相关，提示FFPE标本中 substantially 更大保存相关技术变异性。重要的是，保存相关甲基化分析变异性可能不成比例影响低质量或区域特异性分析，特别是在关注个体生物标志物位点而非广泛全局甲基化趋势的研究中。因此，当甲基化状态用于诊断、预后或治疗决策时，FFPE与新鲜或冷冻组织间验证可能必要。总之，保存相关效应超出DNA序列 alone 并影响表观基因组表征。尽管FFPE对一些甲基化应用仍合适，FF组织通常提供更大定量甲基化分析信心，当个体甲基化生物标志物用于临床决策时可能更可取。

下一代测序RNA转录组学部分指出，当从DNA测序转向转录组分析时，组织保存效应变得 substantially 更显著，因为RNA固有比DNA更不稳定且高度易受酶促降解和化学修饰。因此，组织保存是RNA测序质量、转录本定量和下游生物解释的关键决定因素。RNA测序日益增加的临床重要性超出差异基因表达分析，包括分子亚型、免疫谱分析、融合转录本检测、通路分析和生物标志物发现。因此，保存诱导降解不仅可影响分析性能，还可影响肿瘤状态和治疗脆弱性的生物解释。为评估组织保存如何影响RNA测序性能，本节综合转录组保真度主要决定因素的证据，包括RNA完整性、测序性能、活力细胞群体保存和下游临床效用。这些特征共同定义转录组数据的分析质量并确定保存组织对 bulk 和单细胞RNA测序应用的适用性。RNA完整性和测序性能方面，RNA完整性是转录组数据质量最强预测因子之一。新鲜组织提供转录组分析的生物学参考标准，而速冻通过快速稳定RNA和最小化切除后降解最接近保留天然转录组。FF组织一致显示高RNA完整性数值（RIN ~ 8.0–8.1）、高DV200值（~ 96–97%）、长转录本片段保存和可靠外显子对齐测序且最小映射偏倚。在一项比较研究中，FFPE来源样本显示约13%未映射测序读数相比匹配FF组织仅4%，强调保存对测序质量的实质影响。同样，泛癌比较证明FFPE标本中约15%更少可用测序读数比匹配FF组织。FFPE保存引入RNA片段化、甲醛诱导交联和化学修饰，降低转录本长度并损害测序质量。FFPE来源RNA一致显示显著较低RIN值、降低转录本检测灵敏度、增加未映射读数比例和更大内含子或降解RNA片段表示。尽管全局基因表达谱在匹配FFPE和新鲜组织间通常保持中度至高度相关，固定相关降解不成比例影响低丰度转录本、融合转录本检测、转录本异构体分析和定量表达测量，从而降低FFPE来源RNA可实现生物分辨率。保存影响在胶质母细胞瘤中说明，匹配FFPE样本显示 substantially 降低RNA质量（低2–3倍）和丰度比FF组织，不论储存时间。尽管FFPE标本中成功RNA提取显著较低，转录组分类在限制分析至 curated 基因面板后仍可行，证明分析优化可部分补偿降低RNA质量但不完全恢复天然转录组保真度。转录组保真度和单细胞应用保存方面，除保留RNA完整性外，现代转录组分析日益需要维持活力细胞群体用于单细胞测序。与FF组织在冷冻期间破坏细胞膜不同，控速冷冻保存保留RNA完整性和细胞活力，使下游单细胞RNA测序和功能分析成为可能。多项研究证明冷冻保存组织维持与新鲜组织强转录组一致性同时保留细胞异质性并使准确识别免疫、基质和恶性细胞群体成为可能。冷冻保存和新鲜样本间测序深度与转录本检测间强线性关系同样被观察到，指示冷冻保存后转录组灵敏度最小损失。尽管冻融循环期间可能发生应激反应通路适度激活，这些转录变化通常代表整体转录组小比例并对全局生物解释有最小影响。重要的是，近期研究证明慢冻冷冻保存肿瘤组织仍适合类器官开发、离体培养和单细胞RNA测序同时保留癌症和基质细胞群体。尽管细胞比例轻微差异已有报道，主要转录组差异 largely 限于热休克反应通路，指示控速冷冻保存对许多下游功能应用 closely 近似新鲜组织。转录组分析临床意义方面，RNA测序日益临床采用扩展组织保存重要性超出研究应用 alone。分子亚型、免疫谱分析、基因融合检测和基于表达的生物标志物日益影响治疗决策，使准确转录本定量对精准肿瘤学 essential。尽管现代靶向捕获方法和专门文库制备方案已 substantially 改善FFPE来源组织RNA测序可行性，这些方法主要补偿降解RNA而非恢复天然转录本完整性。因此，FFPE来源RNA经常需要增加测序深度、转录本过滤和分析校正以达到与FF标本可比性能。这些额外处理步骤增加分析复杂性并可能降低定量转录组分析灵敏度。总体而言，文献证明当从基因组转向转录组分析时保存相关效应变得 substantially 更显著。虽然FFPE仍是回顾性研究和档案标本的重要资源，FF组织继续提供最高转录组保真度，控速冷冻保存提供最接近新鲜组织近似同时独特保留活力细胞群体用于单细胞和功能应用。随着精准肿瘤学日益纳入基于RNA的诊断和活细胞技术，维持转录本完整性和细胞活力的保存策略将对最大化转录组谱分析临床效用日益重要。

蛋白质组学部分指出，尽管基因组和转录组分析表征肿瘤分子蓝图，蛋白质组分析通过测量蛋白质丰度、翻译后修饰和信号通路活性提供对细胞功能状态的洞察。因为蛋白质结构动态且化学多样，保存诱导改变可对下游分析性能和生物解释产生不成比例大影响。为评估组织保存对蛋白质组分析影响，本节综合蛋白质组保真度主要决定因素证据，包括蛋白质完整性和检测深度、保存诱导分析伪影和功能信号通路维持。这些特征共同确定保存组织对定量蛋白质组学和磷酸蛋白质组分析的适用性。蛋白质完整性和检测深度方面，天然蛋白质结构保存是准确基于质谱蛋白质组分析的基础。FF组织通过最小化蛋白质降解、维持天然构象状态和保留组织收集时存在的翻译后修饰（PTMs）一致提供最高蛋白质组保真度。跨多项研究，FF组织显示更大蛋白质组深度、改善磷酸蛋白质组检测和更可靠PTMs识别比匹配FFPE标本。定量比较进一步说明保存对蛋白质回收的影响。使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），FF标本产生每样本约1,511个可识别蛋白质相比匹配FFPE组织仅回收947个蛋白质。FFPE标本中观察到的降低检测深度限制低丰度蛋白质表征并降低通路水平分析灵敏度，特别是当有限组织可用时。保存诱导蛋白质组伪影方面，与核酸降解不同，福尔马林固定对蛋白质的主要效应源于广泛分子间交联和化学修饰。甲醛与氨基酸侧链和末端氨基反应形成共价交联，改变蛋白质构象、降低溶解度并修饰质谱期间检测的肽质量。这些保存诱导改变可掩盖天然PTMs并产生复杂化生物解释的人工分子签名。这些分析限制证据已在胰腺腺癌异种移植模型中证明，FFPE标本显示 substantially 更大数量表观组蛋白修饰位点和额外PTMs比匹配FF组织。这些发现提示固定诱导化学改变可模拟内源性PTMs并增加区分生物信号事件与保存伪影的难度。蛋白质组保真度降低额外证据由底物末端胺同位素标记（TAILS）提供，其评估保存后蛋白质N末端。FF组织产生约3,000–3,800个可检测N末端相比匹配FFPE标本仅2,000–2,300个。尽管计算过滤和改进提取方法可降低分析噪声并改善肽回收，这些方法不能完全逆转固定诱导蛋白质交联或恢复天然蛋白质结构。因此，FFPE来源蛋白质组分析通常显示降低检测深度和更大分析变异性比FF组织。功能蛋白质组学和临床意义方面，除蛋白质识别 alone 外，现代蛋白质组分析日益寻求通过磷酸蛋白质组学和激酶活性谱分析表征动态信号网络。因为磷酸化和其他翻译后修饰反映功能细胞状态，这些分子签名保存对理解肿瘤生物学和识别治疗靶点 essential。控速冷冻保存已成为保留动态蛋白质组状态的有前景策略同时提供比新鲜组织更大后勤灵活性。多项研究证明磷酸蛋白质组和激酶信号谱在控速冷冻保存和临床相关冷缺血间隔期间保持显著稳定。在结直肠肿瘤标本经受高达180分钟冷缺血时间 before 保存中，约2,715检测磷酸肽中仅90显示信号强度显著变化，指示绝大多数（~ 97%）磷酸蛋白质组特征在整个收集间隔保持稳定。同样，MALDI成像质谱证明FF组织和保存前短时间4°C储存标本间最小蛋白质组差异，尽管延长缺血最终引入可测量改变。功能蛋白质信号保存对精准肿瘤学有重要含义。蛋白质组和磷酸蛋白质组生物标志物日益被纳入治疗反应、通路激活和药物靶点识别研究。保存诱导蛋白质构象或信号活性改变因此有可能影响生物标志物定量和生物解释。尽管现代提取工作流程已 substantially 改善FFPE来源标本分析效用，FF组织仍是定量蛋白质组学参考标准，而控速冷冻保存提供保留许多功能信号特征连同活力组织用于下游分析的实用替代。总体而言，这些发现证明保存相关效应在蛋白质组水平变得日益重要，因为蛋白质结构和功能上比核酸更敏感。随着精准肿瘤学超越基因组表征朝向功能分子谱分析扩展，维持天然蛋白质结构和信号活性的保存策略将对准确生物标志物评估、治疗靶点识别和临床有意义生物解释日益重要。

个性化癌症疫苗开发部分指出，前述部分证明组织保存影响跨DNA测序、转录组学和蛋白质组学的分子表征。个性化癌症疫苗开发代表从测量这些分子特征到使用它们指导个体化治疗策略的重要过渡。新抗原发现取决于准确识别肿瘤特异性突变并确认其表达，使高质量肿瘤DNA和RNA保存对可靠疫苗靶点选择 essential。此阶段保存相关错误可能传播通过转化工作流程，影响候选新抗原识别、优先排序和验证。尽管最终目标是治疗性的——诱导或扩增能够识别和消除肿瘤细胞的免疫反应——过程始于肿瘤准确分子表征。个性化癌症疫苗因此提供有用例子说明生物样本保存如何影响转化工作流程多个阶段，链接标本分析期间分子保真度与下游治疗开发。此框架亦提供过渡到后续应用，其中保存必须日益维持活力细胞系统、功能反应和治疗效力。新抗原发现保存方面，个性化新抗原疫苗开发始于识别患者正常组织不存在的肿瘤特异性改变。肿瘤DNA因此与匹配正常DNA（通常从外周血获得）一起分析以区分体细胞突变与遗传变异。候选新抗原然后根据变异等位基因频率、肿瘤克隆性、预测主要组织相容性复合体（MHC）结合和突变转录本表达证据等因素优先排序。因为若干这些参数依赖准确DNA和RNA测量，保存相关降解或测序伪影可能影响候选变异检测及其后续优先排序。标本质量直接影响此过程。DNA降解、测序伪影、低肿瘤细胞密度或不足匹配正常数据可产生假阳性或假阴性变异调用。尽管FFPE组织因临床可用性经常使用，福尔马林相关片段化、交联和核苷酸损伤可能复杂化低频或亚克隆突变检测并增加保存相关假阳性或假阴性变异调用可能性。然而，FFPE标本在适当处理和分析时仍适合许多测序工作流程。相关区别因此不是可用与不可用组织间，而是提供不同水平分子保真度和下游灵活性的保存策略间。新鲜冷冻或适当冷冻保存组织通常提供更高质量核酸用于整合DNA和RNA基础分析，因此当预期全面新抗原发现时可能更可取。肿瘤RNA测序进一步精炼候选选择通过确认突变表达和识别可能产生额外抗原的替代转录本、融合、保留内含子或异常剪接 junction。肿瘤纯度和空间异质性亦重要因为基质污染可能降低检测灵敏度，而区域限制突变可能不提供广泛肿瘤覆盖。代表性采样、病理审查、肿瘤富集和DNA与RNA证据整合因此对准确疫苗设计 essential。疫苗制造和产品保存方面，选定新抗原可纳入合成长肽、mRNA、DNA、病毒载体或树突细胞疫苗，每种具有不同制造和保存要求。此阶段保存从维持诊断生物样本完整性转向维持个体化治疗产品稳定性、身份和功能能力。此区别重要因为最终疫苗保存要求平台特异性且不一定等同于用于新抗原发现的肿瘤标本保存要求。肽疫苗相对稳定但需要个体化合成、纯化、身份测试和释放评估。个性化mRNA疫苗可在单一构建体中编码多个新抗原并可能允许更快重新设计，但RNA必须保护免受降解且通常维持于控速冷冻制剂中。RNA完整性和递送颗粒特征保存对维持抗原表达和免疫原性 essential。DNA疫苗化学上比RNA更稳定但依赖有效细胞摄取和抗原表达。病毒载体可提供强表达但引入额外生产、生物安全和免疫考虑。树突细胞疫苗具有最严格保存要求因为含活力自体细胞。最终产品必须保留活力、抗原呈递能力、成熟表型和T细胞 priming 活性。控速冷冻保存可支持批次制造、释放测试、运输和重复给药，但解冻后评估应包括恢复和功能效力而非仅活力。因此，个性化癌症疫苗开发说明转化两个不同保存依赖阶段：肿瘤来源分子信息保存用于准确靶点识别和治疗产品保存用于安全有效临床给药。临床和转化意义方面，主要转化挑战是在临床有意义间隔内完成个体化工作流程。此过程包括组织获取、测序、HLA分型、新抗原预测、疫苗设计、制造、质量测试和治疗递送。差组织质量或不足RNA可延迟过程并可能在快速进展疾病患者中尤为后果严重。新抗原预测仍不完美。预测MHC结合不保证肽将自然加工、呈递或被有效T细胞 repertoire 识别。候选选择日益纳入RNA表达、克隆性、抗原加工预测和免疫验证，但通常仅预测新抗原子集诱导可测量免疫。早期临床研究证明个性化肽和RNA疫苗可在黑色素瘤、胶质母细胞瘤、胰腺癌和其他恶性肿瘤中产生新抗原特异性CD4阳性和CD8阳性T细胞反应。在胰腺导管腺癌中，个性化mRNA疫苗在患者子集中产生扩增新抗原特异性T细胞反应，证明术后治疗期间个体化疫苗生产可行性。与免疫检查点阻断组合可能进一步增强活性通过产生肿瘤特异性T细胞同时降低肿瘤微环境内抑制信号。早期研究支持此方法可行性，尽管需要更大型对照试验建立一致临床益处。总之，个性化癌症疫苗连接分子信息保存与功能抗肿瘤免疫产生。其成功取决于准确肿瘤和匹配正常测序、突变表达确认、高效制造和最终疫苗产品保存。

功能精准医学和活组织科学部分指出，功能精准医学使用活力患者来源细胞或组织直接测量治疗反应并补充基于分子生物标志物的预测。这些方法包括短期培养、组织切片、类器官和患者来源异种移植。因为保存相关损伤可改变细胞恢复、细胞组成和 apparent 药物敏感性，保存质量是这些测定可靠性的核心。活力组织保存方面，新鲜肿瘤组织仍是功能测试的生物学参考标准因为最接近保留切除时存在的细胞组成和生理状态。从新鲜标本建立的患者来源类器官可保留亲本肿瘤的组织学、基因组、转录组和药理学特征。然而，新鲜组织需要快速运输和立即处理，限制跨地理分布临床站点使用。控速冷冻保存提供更大后勤灵活性通过分离组织获取与下游处理。慢冻肿瘤组织已支持二维培养、三维类器官、离体培养和单细胞RNA测序产生，结果与新鲜处理材料广泛可比。冷冻保存活肿瘤标本亦保留活力恶性细胞、组织形态和足够功能完整性用于 later 药物敏感性测试。从冷冻保存卵巢癌组织来源类器官同样保留源肿瘤主要组织学、基因组和转录组特征。冷冻保存不无变化保留所有细胞组分。冻融损伤可能降低总细胞恢复、改变脆弱细胞群体相对丰度和诱导短暂应激反应。功能验证因此应评估不仅活力，还有肿瘤细胞表示、基质和免疫组成、增殖能力和模型建立效率。治疗反应保存方面，最临床重要标准是保存组织是否再现新鲜材料治疗反应。在比较研究中，从慢冻、DMSO保存组织产生类器官显示形态、代谢活动和药物反应模式更接近新鲜来源类器官比从速冻组织产生者。慢冻结直肠肿瘤组织同样产生具有与新鲜标本可比生长和活力特征类器官。冷冻保存卵巢癌标本亦产生类器官其药物反应谱与临床治疗结果相关，尽管培养条件影响预测性能。这些发现指示保存仅是变异性一个来源；缺血时间、肿瘤细胞密度、解离方法、培养基、测定持续时间和药物暴露条件亦可影响 apparent 治疗反应。FFPE组织与直接功能测试不兼容因为固定消除细胞活力。速冻偶尔可能允许类器官恢复，但其性能似乎比控速冷冻保存对需要可重复细胞恢复和药物反应应用更不可预测。临床实施方面，功能精准医学意欲补充分子谱分析。基因组分析可识别潜在可操作改变，而功能测试测量患者来源组织是否在肿瘤整合生物背景中对治疗反应。此组合当分子发现模糊或多种治疗选项可用时可能特别有用。前瞻性研究支持类器官指导测试在临床相关时间线内可行性。在晚期胰腺癌中，类器官筛选为大多数可评估患者识别至少一种潜在活性治疗，尽管常规临床采用前前瞻性介入验证仍必要。类器官药物敏感性与临床反应间关联亦在乳腺、结直肠、膀胱和卵巢癌中报道。冷冻保存可通过使集中测试、多中心研究、活力组织生物样本库和随着新治疗可用 later 重新评估成为可能来扩展 access。这些优势必须平衡 against 需要控制冷冻、监测储存、标准化解冻和分析前变量文档。总体而言，证据指示当目标从测量分子组成转向评估活肿瘤行为时保存要求根本改变。新鲜组织提供即刻生物状态最接近表示，而控速冷冻保存当前提供保留活力组织和临床相关治疗反应模式最实用替代。此从分子保真度到功能保真度过渡亦建立TIL分离和工程T细胞制造框架。

肿瘤浸润淋巴细胞治疗和活组织科学部分指出，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）治疗扩展功能精准医学从测量药物反应到保存活免疫细胞用于治疗用途。成功TIL制造取决于回收保留增殖能力、细胞因子产生、迁移行为和细胞毒功能的活力肿瘤反应性淋巴细胞。保存策略因此不仅影响分析质量，还影响最终细胞产品可行性和效力。细胞恢复和扩增方面，新鲜肿瘤组织仍是TIL分离首选来源因为最大化初始细胞恢复并避免冻融损伤。然而，立即处理产生与运输、专门实验室 access 和集中制造相关的实质后勤约束。控速冷冻保存提供更大灵活性通过允许肿瘤组织或分离淋巴细胞在扩增前储存。冷冻保存T细胞经常显示解冻后活力接近或超过90%并保留解冻后增殖能力。在匹配结直肠肿瘤标本中，冷冻保存组织支持后续T细胞恢复和扩增，尽管观察到选定免疫细胞群体相对丰度变化。细胞恢复可能比活力 alone 对冷冻应激更敏感。液氮储存期间反复温度波动产生仅适度PBMC活力降低但 substantially 降低解冻和过夜培养后可回收细胞数量。同样，延长冷冻保存与可用于测序的较低细胞数量和CD4+和CD8+ T细胞恢复选择性差异相关。这些发现指示保存TIL材料评估应包括恢复产量和扩增成功 in addition to 百分比活力。免疫功能保存方面，保存TILs临床价值取决于解冻后维持抗肿瘤功能。在实验研究中，冷冻保存细胞毒性T淋巴细胞显示与新鲜培养细胞可比活力并保留激活标志物表达、增殖能力和靶细胞杀伤跨常规和三维培养测定。冷冻保存和新鲜T细胞亦显示可比通过胶原基质迁移和抗原暴露后相似干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α产生。然而，功能保存跨研究不统一。从结直肠肿瘤分离的冷冻保存T细胞显示降低干扰素-γ分泌比匹配新鲜来源细胞，尽管维持解冻后扩增能力。冷冻保存时机亦可能影响表型，细胞在离体扩增数天后冷冻显示比立即分离后冷冻细胞更大解冻后表型稳定性。FFPE保存与TIL治疗不兼容因为固定不可逆消除细胞活力和功能能力。临床转化方面，冷冻保存已成为TIL治疗临床递送 integral 因为允许扩增细胞产品经历释放测试、运输、储存和协调输注。冷冻保存TIL产品临床经验证明活力、肿瘤反应性淋巴细胞可制造、储存、解冻和再输注同时保留治疗活性。在TIL分离前保存肿瘤组织可能性可进一步扩展 access 通过分离手术收集与专门细胞处理设施。此方法可支持集中制造、多中心治疗计划和更灵活处理时间线。然而，需要前瞻性验证确定储存持续时间、冷冻保护剂组成、组织格式和解冻方案如何影响TIL恢复、细胞组成、扩增成功和治疗效力。总体而言，新鲜组织提供最高初始TIL恢复，而控速冷冻保存在功能保存和临床可扩展性间提供最佳平衡。尽管冷冻保存通常维持活力和抗肿瘤活性，细胞恢复、表型和效力标准化评估仍 essential。

T细胞分离和CAR-T治疗和活组织科学部分指出，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗扩展活组织科学到多步制造过程其中患者来源T细胞被收集、遗传修饰、扩增、储存和再输注。成功治疗因此取决于维持细胞活力、增殖能力、转基因表达和抗肿瘤功能贯穿制造和分配工作流程。起始材料和制造能力保存方面，新鲜白细胞单采材料提供高质量起始细胞用于CAR-T制造，但立即处理经常不切实际因为生产可能在集中设施发生。冷冻保存允许收集、制造和治疗调度分离同时支持运输、质量测试和需要时重复处理。冷冻保存外周血单核细胞和白细胞单采产品通常仍适合CAR-T制造。尽管冷冻可能降低选定细胞群体恢复或减慢早期扩增，从冷冻保存起始材料产生CAR-T细胞可保留表型、细胞因子产生、转导效率和体外细胞毒性与从新鲜细胞产生产品可比。在临床制造队列中，冷冻保存PBMCs降低恢复与较低转导效率、最终CAR-T产量、体外反应性或临床反应不相关。CAR-T细胞功能保存方面，冷冻保存亦通常应用于最终工程细胞产品。控速冷冻与冷冻保护剂如二甲基亚砜可保留解冻后CAR表达、膜完整性、细胞表型和靶特异性细胞毒性。抗BCMA CAR-T细胞冷冻保存后保留转导率和主要T细胞亚群，尽管观察到凋亡短暂增加和选定功能测量变化。临床和实验比较指示冷冻保存CAR-T产品可维持足够扩增和抗肿瘤活性用于治疗用途。制造期间冷冻CAR-T细胞可解冻、再扩增至治疗相关数量并成功给药，证明中断制造工作流程可能仍可行。然而，解冻后评估应包括活力细胞恢复、扩增、表型、CAR表达、细胞因子产生和细胞毒效力而非依赖活力 alone。FFPE保存与CAR-T制造不兼容因为固定消除细胞活力。FFPE组织仍可支持工程T细胞回顾性定位和表型表征使用专门原位杂交和免疫组织化学方法，但不能提供细胞用于治疗生产。实验速冻和玻璃化方法可能在严格受控条件下保留T细胞活力，但其设备、升温速率和样本体积要求当前限制常规制造使用。临床可扩展性方面，冷冻保存已成为CAR-T递送核心因为使集中制造、产品释放测试、运输、储存和协调淋巴细胞清除与输注成为可能。当治疗必须延迟或制造细胞需要额外测试 before 给药时亦可提供灵活性。保存仍是产品质量仅一个决定因素。患者治疗史、白细胞单采时淋巴细胞适应性、制造持续时间、细胞组成、储存条件、解冻程序和输注前延迟亦可能影响最终产品。这些变量标准化控制因此对比较新鲜和冷冻保存工作流程 essential。总体而言，冷冻保存提供CAR-T功能保存与现代细胞治疗制造后勤要求间最实用平衡。尽管可能发生恢复适度损失或短暂细胞应激，适当控制冷冻保存通常保留临床使用所需制造能力和抗肿瘤活性。长期储存方面，冷冻保存使肿瘤组织和血液来源生物样本在超低温长期保存同时维持分子和在一些情况下细胞完整性用于未来下游分析。通过最小化酶促降解、核酸片段化和代谢活性，冷冻保存允许生物样本保持适合应用包括基因组谱分析、转录组学、蛋白质组学、功能医学测试、类器官开发和免疫治疗相关研究。在延长期间保存生物相关组织能力对精准肿瘤学有重要含义。随着治疗策略演变和耐药机制随时间出现，存档冷冻保存组织可提供机会用于回顾性分子表征、识别新可操作基因组改变、治疗反应建模或入组生物标志物驱动临床试验无需重复组织获取。这在有限组织可用性或肿瘤位于解剖挑战部位其中重复活检携带额外程序风险患者中可能特别有价值。与FFPE保存相比，冷冻保存组织维持更大分子保真度跨DNA、RNA、蛋白质和活力细胞应用。重要的是，活力细胞群体保存额外使下游功能分析成为可能其使用FFPE来源标本不可行，包括类器官产生、单细胞测序、TIL扩增和功能精准医学测试。然而，成功长期冷冻保存需要大量基础设施，包括控速冷冻方案、液氮或超低温储存系统、连续温度监测和标准化生物样本处理工作流程。尽管这些后勤挑战，多组学谱分析和活细胞功能测定日益整合入精准肿瘤学工作流程已扩展对前瞻性生物样本库策略兴趣其保存组织于与当前和未来分子应用兼容状态。随着精准医学继续演变，长期冷冻保存将在维持临床和生物信息生物样本用于转化研究和患者特异性治疗决策中发挥日益重要作用。总体而言，这些发现支持前瞻性、分层生物样本管理方法而非依赖单一保存方法。常规组织病理诊断所需组织应分配给FFPE，而额外材料应通过速冻或控速冷冻保存根据预期分子和功能应用保存。当足够组织可用时，冷冻保存保留最广泛未来选项因为活力材料可随后支持分子谱分析、功能精准医学、类器官开发和细胞治疗研究。此标本分配策略提议框架显示于图4。

结论部分指出，此处综述证据证明组织保存不仅是分析前考虑而是分子和功能数据质量基本决定因素。随着精准肿瘤学日益将基因组、转录组、蛋白质组、表观遗传和活细胞分析纳入临床决策，生物样本管理必须演变超越主要为组织病理评估开发的工作流程。实用方法是前瞻性分诊肿瘤标本根据其预期下游应用通过分配足够组织用于常规FFPE诊断同时保存额外材料通过速冻或控速冷冻保存用于分子和功能分析。此策略已在若干机构成功实施，包括荷兰超过一半癌症中心其中FF组织优先用于全基因组测序。尽管实质进展已改善FFPE来源标本分析性能，许多这些改善依赖日益复杂提取方案、文库制备方法和生物信息学校正策略设计用于补偿保存诱导分子损伤，此实践称为 rescue science。集体证据提示分子保真度可比或更大改善可通过分析测试开始前优化生物样本收集和保存实现。重要的是，这不削弱FFPE在常规病理学中不可或缺角色；而是强调保存策略应与预期临床或研究应用匹配并应被视为测定设计一部分而非独立分析前变量。最终，分子表征价值不在于仅产生技术可重复数据，而在于产生改善患者护理的临床有意义信息。不论保存方法，分子测定必须证明临床有效性 before 可有意义指导治疗决策。如本综述证明，保存相关改变随着分子分析从DNA测序推进到RNA谱分析、蛋白质组学并最终功能活细胞应用而日益重要。因此，维持更高分子保真度的保存方法可能对需要定量分子测量或活力细胞功能保存的应用提供更大临床效用。类器官模型、功能精准医学测试、单细胞测序、TIL治疗和CAR-T制造出现进一步扩展生物样本保存角色超出分子表征 alone。控速冷冻保存一致证明最接近新鲜组织近似跨许多这些下游应用同时提供纵向生物样本库和多中心精准肿瘤学程序所需灵活性。而非对每个标本采用单一保存策略，未来精准肿瘤学工作流程可能受益于分层生物样本保存方法平衡诊断病理学、分子保真度、活力细胞功能保存、后勤可行性和长期临床效用。在此框架中，FFPE对常规组织病理学和形态学基础评估仍有利，新鲜组织用于立即功能询问，速冻组织用于分子分析物快速保存，控速冷冻保存当保留活力组织和未来功能应用为优先。此类方法认识到最佳保存方法不仅取决于组织本身，还取决于组织意欲支持的生物问题和治疗决策。