盐酸伐地那非片在中国健康受试者中的生物等效性研究

《Drugs in R&D》：Bioequivalence Study of Vardenafil Hydrochloride Tablets in Healthy Chinese Subjects

　　

背景与目的：盐酸伐地那非（vardenafil hydrochloride）是一种磷酸二酯酶5型（PDE5）抑制剂，用于治疗勃起功能障碍（ED）。仿制片剂在中国注册需进行生物等效性（BE）评价。本研究旨在考察盐酸伐地那非片在中国健康志愿者空腹和餐后条件下的生物等效性。方法：采用单中心、随机、开放标签、两制剂、单剂量、四周期、完全重复交叉设计。空腹试验和餐后试验分别入组24名和30名健康受试者。按照研究方案采集静脉血样本，采用液相色谱-串联质谱法（LC–MS/MS）测定血浆中伐地那非浓度。所有数据采用SAS 9.4版进行统计分析，随后进行生物等效性评价。结果：空腹条件下，受试制剂（T）和参比制剂（R）的最大血浆浓度（C_max）分别为37.10 ± 16.62 ng/mL和34.76 ± 16.21 ng/mL；达峰时间（T_max）中位数（范围）分别为0.67 h（0.34–1.50）和0.67 h（0.34–1.00）；从零时至最后可定量浓度时间的血浆浓度-时间曲线下面积（AUC_0–t）分别为78.66 ± 44.29 ng·h/mL和75.61 ± 40.81 ng·h/mL；从零时至无穷大的血浆浓度-时间曲线下面积（AUC_0–∞）分别为81.44 ± 45.59 ng·h/mL和78.30 ± 41.51 ng·h/mL。餐后条件下，T和R的C_max分别为25.02 ± 14.54 ng/mL和26.52 ± 14.23 ng/mL；T_max分别为1.34 h（0.25–4.50）和1.50 h（0.50–5.00）；AUC_0–t分别为98.81 ± 47.50 ng·h/mL和91.20 ± 45.67 ng·h/mL；AUC_0–∞分别为101.68 ± 48.28 ng·h/mL和94.08 ± 46.26 ng·h/mL。在空腹和餐后条件下，受试制剂与参比制剂主要药代动力学参数（包括C_max、AUC_0–t和AUC_0–∞）几何均值比的90%置信区间均完全落在预设的生物等效性接受范围80.00–125.00%内。结论：在中国健康受试者空腹和餐后条件下口服给药后，盐酸伐地那非受试制剂与参比制剂在吸收速率和吸收程度方面均具有生物等效性。

研究背景：勃起功能障碍（ED）是一种 prevalent 的男性性功能障碍，定义为持续至少6个月无法达到和维持足以完成满意性交的阴茎勃起。流行病学研究显示，40岁男性中ED患病率约为40%，而70岁左右男性中升至约70%。随着全球人口老龄化加剧，预计到2025年全球将有近3.2亿男性受ED影响。盐酸伐地那非作为一种新型高选择性磷酸二酯酶5型（PDE5）抑制剂，通过抑制阴茎海绵体中PDE5介导的环磷酸鸟苷（cGMP）降解，增强性刺激时内源性一氧化氮（NO）释放的效应，从而诱导海绵体平滑肌松弛，增加阴茎勃起组织血流灌注。根据国家《关于开展仿制药质量和疗效一致性评价的意见》及化学仿制药生物等效性研究系列指导原则，仿制片剂注册需进行生物等效性（BE）评价。本研究由江苏万高药业股份有限公司生产的仿制盐酸伐地那非片开展，按照NMPA指南及相关国际技术规范，采用随机、开放标签、两制剂、单剂量、四周期、完全重复交叉设计，采用LC–MS/MS测定血浆伐地那非浓度并计算主要药代动力学参数，旨在评价受试制剂与参比制剂在健康受试者中的生物等效性。

研究人员开展的研究：本研究为单中心、随机、开放标签、两制剂、单剂量、四周期、完全重复交叉设计。空腹试验入组24名健康男性受试者，餐后试验入组30名健康男性受试者，年龄18–65岁，体重≥50.0 kg，BMI 19–26 kg/m²。受试者随机分为A组（T-R-T-R序列）和B组（R-T-R-T序列），相邻周期之间设置3天洗脱期。空腹试验中受试者禁食至少10小时后单次口服20 mg受试制剂或参比制剂；餐后试验中受试者在给药前30分钟内进食标准高脂早餐（约800 kcal，脂肪52%、蛋白质18%、碳水化合物30%）。空腹条件下于给药前1小时内及给药后10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、1 h、1.25 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h和24 h共16个时间点采集静脉血；餐后条件下于给药前1小时内及给药后0.25 h、0.5 h、0.75 h、1 h、1.33 h、1.67 h、2 h、2.33 h、2.67 h、3 h、3.5 h、4 h、4.5 h、5 h、6 h、7 h、8 h、12 h和24 h共20个时间点采集静脉血。每次采集约4 mL静脉血至含EDTA-K₂抗凝剂的真空采血管中，60分钟内于4 °C、1700g离心10分钟，分离血浆分装于两支标记冻存管中，于?80 °C超低温冰箱保存至药代动力学分析。采用液相色谱-串联质谱法（LC–MS/MS）测定血浆伐地那非浓度。药代动力学参数采用非房室分析（NCA）以Phoenix WinNonlin 7.0版计算，生物等效性统计分析采用SAS 9.4版。主要药代动力学参数包括C_max、AUC_0–t和AUC_0–∞，经自然对数转换后采用线性混合效应模型分析，制剂、周期和序列效应为固定效应，序列内嵌套受试者为随机效应。当参比制剂日内变异标准差（S_WR）< 0.294时采用平均生物等效性（ABE），计算几何均值比（GMRs）及其90%置信区间（CIs），若C_max、AUC_0–t和AUC_0–∞的90% CIs完全落在80.00–125.00%范围内则判定生物等效；当S_WR ≥ 0.294时采用参比制剂标度的平均生物等效性（RSABE），以单侧95%置信区间上限≤ 0为接受标准。安全性数据基于安全性集（SS）进行描述性统计。样本量估算基于既往文献报道的参数变异度（CV > 30%），伐地那非被归类为高变异药物，假定几何均值比为1.1、受试者内变异系数为36%、生物等效性接受范围为80.00–125.00%，取α = 0.05、β = 0.2，采用PASS 15软件估算所需样本量为24例，考虑脱落风险空腹试验入组24名健康志愿者，鉴于餐后条件下C_max受试者内变异度更高，餐后队列入组30名受试者以确保足够统计功效和可靠生物等效性结果。

研究结论及其重要意义：受试制剂盐酸伐地那非片在空腹和餐后条件下均与参比制剂（Levitra?）具有相似的吸收速率和吸收程度，受试制剂伴有轻度不良事件且安全性良好，被确认与参比制剂生物等效。本研究为仿制盐酸伐地那非片在中国注册提供了关键生物等效性证据，并采用四周期完全重复交叉设计精确量化了餐后队列中C_max受试者内变异度的升高，为高变异药物在餐后条件下的生物等效性评价提供了方法学参考。

关键技术方法概述：本研究采用单中心、随机、开放标签、两制剂、单剂量、四周期、完全重复交叉设计，空腹和餐后试验分别入组24名和30名健康男性受试者（中国健康志愿者队列）。血浆伐地那非浓度采用液相色谱-串联质谱法（LC–MS/MS）定量，以氘代伐地那非（vardenafil-d5）为内标，蛋白沉淀法预处理样本，电喷雾离子化正离子模式多反应监测（MRM）检测。药代动力学参数采用非房室分析（NCA）以Phoenix WinNonlin 7.0版计算，生物等效性统计采用SAS 9.4版混合效应模型分析，并根据参比制剂S_WR分别采用ABE或RSABE方法评价。

研究结果：

4.1 受试者完成情况：空腹试验入组24名健康志愿者，23名完成全部研究，受试者K24在第一洗脱期退出，24名入组受试者均纳入全分析集（FAS）和安全性集（SS），因K24退出，第二、三、四周期血样数据缺失，故第一周期24名、第二至四周期23名受试者纳入药代动力学浓度集（PKCS）、药代动力学参数集（PKPS）和生物等效性集（BES）。餐后试验入组30名健康志愿者，29名完成全部研究程序，受试者A19在第四周期给药后两倍中位T_max内发生呕吐，该周期数据从BES中排除，故第一至三周期30名、第四周期29名受试者纳入BES。

4.2 血浆药物浓度测定结果与药代动力学参数：空腹和餐后条件下单次口服受试制剂（T）和参比制剂（R）后健康男性志愿者的平均血浆浓度-时间曲线整体趋势一致。餐后条件下高脂饮食对盐酸伐地那非片吸收 profile 产生显著食物效应而不改变总全身暴露，餐后受试者C_max受试者内变异度增加，需采用RSABE而非传统ABE标准进行餐后生物等效性评价。

4.3 生物等效性分析：空腹条件下C_max、AUC_0–t和AUC_0–∞的几何均值比（受试制剂/参比制剂）90%置信区间分别为96.52–115.47%、96.70–108.45%和96.60–108.32%；餐后条件下相应值分别为80.77–106.91%、103.54–114.06%和103.38–113.25%。所有区间均落在预设生物等效性接受范围80.00–125.00%内，证明两种制剂在两种条件下均生物等效。餐后队列中C_max因受试者内变异度高（S_WR = 0.330）采用RSABE标准评价，RSABE接受标准得到满足。

4.4 生物分析方法验证结果：

4.4.1 特异性和线性：六批空白人血浆中伐地那非和伐地那非-d5保留时间处未观察到内源性色谱干扰。加权线性回归方程为Y = 0.0780X + 0.00057（Y为伐地那非与伐地那非-d5峰面积比，X为伐地那非血浆浓度），线性浓度范围0.20–60.00 ng/mL内决定系数（R²）为0.9992，验证的低定量限（LLOQ）为0.20 ng/mL。

4.4.2 精密度、准确度和提取回收率：批内和批间精密度与准确度方面，LLOQ样本变异系数（CV）< 20%，低、中、高质量控制（LQC、MQC、HQC）样本CV < 15%，所有QC样本准确度在85–115%范围内，LLOQ准确度在80–120%范围内，完全符合生物分析验证接受标准。提取回收率仅对校准范围内常规QC浓度（12.00和60.00 ng/mL）评价，平均提取回收率分别为97.15%和91.63%，总平均回收率为96.02%，总CV为3.06%。

4.4.3 基质效应、稀释完整性和稳定性：基质效应在低浓度（0.600 ng/mL）和高浓度（45.0 ng/mL）下于六批人血浆中评价，平均准确度偏差分别为?7.70%至6.38%和?6.78%至4.82%，相对标准偏差（CV）≤ 5.03%，符合预设验证限度。稀释完整性经5倍稀释（n = 6）验证，稀释QC（理论浓度240.0 ng/mL）实测平均浓度为233.2 ng/mL，CV为2.89%，平均准确度为97.17%。所有稳定性评估均按方法部分规定的储存温度和保持时间进行，包括对照品储备液和工作液短期与长期储存、血浆在?20 °C和?80 °C下四次冻融循环、室温台面储存23小时、?20 °C冷冻储存41天及?80 °C冷冻储存41天和140天、处理后样品4 °C自动进样器储存99小时及95小时后进样重现性测试，所有分析数据均在预设接受范围内，充分支持本生物等效性试验中可靠的样本采集、运输、冷冻保存和后续生物分析。

4.5 安全性评价：空腹试验中10名受试者共发生16例不良事件（AEs），受试者发生率为41.7%，所有16例AEs均为轻度，其中11例完全恢复至正常或基线水平，1例好转，4名受试者中止随访检查，未报告严重AEs或导致受试者退出的AEs。餐后试验中12名受试者观察到33例AEs，受试者发生率为40.0%，所有33例AEs均为轻度，29例恢复至基线或正常状态，1例好转，3例失访，未发生严重AEs，但1例AE导致受试者退出。药物不良反应（ADRs）方面，空腹试验中3名受试者发生5例ADRs，受试者发生率为12.5%，所有5例ADRs均为轻度并完全恢复至正常或基线水平，未观察到严重ADRs或导致退出的ADRs。餐后试验中3名受试者报告5例ADRs，受试者发生率为10.0%，所有5例ADRs均为轻度并完全恢复至正常或基线水平，未发生严重ADRs或导致退出的ADRs。

讨论部分总结：盐酸伐地那非由拜耳和葛兰素史克联合开发，随后在欧盟、美国等地区获批上市。与西地那非等其他PDE5抑制剂相比，伐地那非具有独特的咪唑三嗪酮稠环核心，分子骨架和官能团排列不同，对PDE5的选择性显著高于西地那非，对其他磷酸二酯酶亚型的抑制活性较弱，该特性大幅降低不良反应风险，具有更优的安全性和耐受性 profile。基于空腹和餐后生物等效性发现，研究人员进一步讨论了盐酸伐地那非片的药代动力学特征：吸收方面，口服伐地那非在健康志愿者中吸收迅速，参比制剂空腹条件下中位T_max为0.67 h，高脂早餐显著延长中位T_max至1.50 h并降低几何均值C_max（p < 0.05），AUC_0–∞无统计学显著差异，证实高脂饮食对伐地那非吸收动力学的确切影响；C_max受试者内S_WR从0.205（空腹，CV = 20.75%）增至0.330（餐后，CV = 33.95%），根据NMPA统计学指导原则，伐地那非归类为高变异药物，空腹和餐后试验臂分别采用ABE和RSABE标准。分布方面，伐地那非血浆蛋白结合率为94–95%，包括白蛋白和α1-酸性糖蛋白，优先分布于阴茎海绵体组织，四个交叉周期未观察到药物蓄积，与参比制剂分布特征一致。代谢方面，伐地那非经肝脏CYP3A4介导的广泛氧化代谢，主要代谢物M1保留约13%的母药PDE5抑制活性，肠道首过代谢对总清除率贡献极小，筛选时排除使用CYP抑制剂或诱导剂的受试者，最大限度减少PK数据集中潜在代谢干扰。消除方面，实测终末t_?为3.41–3.92 h，约91%给药剂量以代谢物形式经粪便排泄，<6%经尿液排泄，3天洗脱期足以消除周期间残留药物，未观察到 carry-over 效应。影响PK profile的主要因素包括：食物效应（高脂餐延迟胃排空并增加C_max变异度，为餐后队列采用RSABE的根本原因）、CYP450调节剂（酶抑制剂或诱导剂可改变全身暴露，使用此类药物的受试者被排除）、群体生理学（年龄和肝功能可影响清除率，仅入组18–65岁健康志愿者以最小化该偏倚）、胃pH（可能轻微影响溶出速率但对总AUC无显著影响）。吸收速率和峰浓度的显著食物效应代表该制剂的核心药代动力学特征，提示需要快速起效的患者空腹给药可能更优。研究人员进一步基于已发表临床药代动力学数据比较了伐地那非与西地那非和他达拉非的核心药代动力学 profile：伐地那非和他达拉非为BCS 2类（低溶解度）药物，西地那非为BCS 1类药物，该差异部分解释了伐地那非（15%）与西地那非（38–41%）口服生物利用度的不同；与本研究空腹队列实测中位T_max 0.67 h一致，伐地那非吸收快于西地那非（T_max 1.0–1.2 h）和他达拉非（T_max约2 h）；高脂餐对三种药物影响各异，西地那非C_max和AUC同时降低，伐地那非仅表现为T_max延长和C_max降低而总暴露不变（如本试验所观察），他达拉非吸收受食物影响极小；消除方面，伐地那非和西地那非半衰期短（3.4–5 h），他达拉非终末半衰期长约17.5 h，与其长效临床 profile 一致；三种药物均主要经CYP3A4代谢，但仅西地那非和伐地那非产生药理学活性循环代谢物。研究人员将本研究中中国志愿者口服伐地那非20 mg的药代动力学特征与既往已发表相同剂型人体药代动力学研究进行比较，所有口服伐地那非片研究均显示一致的核心吸收和消除特征：空腹条件下快速吸收，中位T_max < 1 h，终末半衰期在3.4–4.2 h范围内，与本研究中实测t_? 3.41–3.92 h一致；高脂餐延长T_max并降低C_max，但在总体全身暴露方面观察到种族差异，Rajagopalan等报道高脂餐后白种人志愿者C_max和AUC_0–∞均降低，而本研究中中国受试者及两项国内生物等效性试验中AUC无统计学显著变化，该差异可能归因于人群间肝脏CYP3A4活性差异。多数国内生物等效性研究采用标准两周期交叉设计，而本研究采用的四周期完全重复交叉设计能够精确量化餐后队列中升高的C_max受试者内变异度。已发表的鼻内伐地那非数据也显示通过避免胃肠道首过代谢可实现显著更快的吸收，尽管消除半衰期与口服片剂相当。尽管本研究设计良好并得出明确结论，但存在若干局限性：第一，所有入组受试者均为健康成年男性志愿者，其生理状况与典型ED患者不同，将本研究药代动力学发现外推至临床人群时应谨慎；第二，本研究仅评价单次给药后生物等效性，而伐地那非临床常用为按需长期治疗，尽管单次给药数据可预测多次给药后稳态药代动力学，仍需真实世界环境中的进一步研究确认长期使用期间药代动力学一致性和长期安全性。

研究结论翻译：本研究结果表明，盐酸伐地那非受试制剂在空腹和餐后条件下均与参比制剂（Levitra?）具有相似的吸收速率和吸收程度。受试制剂伴有轻度不良事件且安全性 profile 良好，被确认与参比制剂生物等效。