《Gastric Cancer》：Beyond CDH1: expanded multigene testing reveals additional predisposition genes in hereditary gastric cancer in Brazil
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背景：家族性易感性约占胃癌（GC）的10%，其中1%–3%与已知高外显率GC易感基因的种系致病性变异（GPVs）相关。然而，遗传性GC的综合分析仍然有限，当前策略在很大程度上仍以CDH1相关的遗传性弥漫性胃癌为中心。本研究旨在评估CDH1及其他癌症易感基因（C
背景：家族性易感性约占胃癌（GC）的10%，其中1%–3%与已知高外显率GC易感基因的种系致病性变异（GPVs）相关。然而，遗传性GC的综合分析仍然有限，当前策略在很大程度上仍以CDH1相关的遗传性弥漫性胃癌为中心。本研究旨在评估CDH1及其他癌症易感基因（CPGs）中的GPVs对家族性和早发性GC的贡献。方法：研究人员应用五项扩展的临床标准来识别具有遗传性GC风险的患者。对115例肠型、弥漫型或混合型胃癌患者使用包含26–113个CPGs的多基因panel进行基因检测。结果：在15.7%的患者中鉴定出GPVs，包括CDH1（4.3%）、MUTYH单等位基因（4.3%）、TP53（3.5%——均为p.Arg337His奠基者变异）、ATM（1.7%）以及CHEK2和MLH1（各0.9%）。此外，6%的患者携带优先关注的临床意义不明变异。研究人员将全部GC队列（290例患者）中MUTYH p.Gly396Asp和p.Tyr179Cys的患病率与巴西对照人群进行了比较（OR：2.2；95% CI 0.96–4.93；p = 0.06）。位于远端食管或贲门的肿瘤患者GPVs频率（38.9%）高于其他部位肿瘤患者（12.4%）（p = 0.01）。GPVs对其他临床特征无显著影响。结论：在这个探索性巴西队列中，多基因检测揭示了超越CDH1的异质性GPVs谱，包括复发性TP53 p.Arg337His奠基者变异，强调了在考虑种系检测时进行全面肿瘤遗传学评估和人群特异性背景的重要性。
研究背景方面，胃癌仍是全球重大健康负担，是癌症相关死亡的第五大原因，具有显著的分子和形态学异质性，由遗传因素和幽门螺杆菌感染、饮食、肥胖等环境触发因素共同驱动。胃癌按Lauren分型分为弥漫型或肠型，或按解剖位置分为贲门（含远端食管）和非贲门肿瘤。一级亲属胃癌家族史可使胃癌风险增加2至10倍。家族性胃癌聚集约占胃癌病例的10%，但仅1%至3%被归类为遗传性病例。基于临床表型，三种主要的遗传性胃癌综合征以胃癌为突出特征：遗传性弥漫性胃癌（HDGC）与CDH1和CTNNA1种系致病变异相关；胃腺癌及近端胃息肉病（GAPPS）与APC基因GPVs相关；家族性肠型胃癌（FIGC）的遗传基础仍不明确且可能具有异质性。此外，Lynch综合征、Li-Fraumeni综合征、幼年性息肉病综合征、Peutz-Jeghers综合征及遗传性乳腺癌卵巢癌综合征等多种癌症易感综合征中也有胃癌风险增加的报道。CTNNA1已被确认为第二个HDGC易感基因，估计约占HDGC家族的2%。因此，已有10个以上癌症易感基因与胃癌相关，但大多数基因的相关风险和 penetrance 仍 largely 未知。早期遗传研究通常纳入小型、高度选择的队列，主要依据国际胃癌连锁联盟（IGCLC）标准设计以研究HDGC。近年来，多项多基因panel研究拓宽了不同人群中胃癌种系易感性的特征描述，但巴西人群尚无可比数据。在巴西，胃癌患者种系致病变异频率很大程度上未被探索，仅发表的四项研究仅评估了CDH1基因，共评估了101例经早发性胃癌或HDGC临床标准选择的患者，仅描述了1个CDH1明确致病变异及若干CDH1临床意义不明变异（VUS）。因此，巴西疑似遗传性胃癌患者种系变异的更广泛谱系仍未明确。本研究旨在描述巴西弥漫性和非弥漫性胃癌疑似遗传性癌症风险患者中癌症易感基因种系致病变异的图谱。
研究人员从GE4GAC项目中筛选 eligible 患者，纳入2017至2021年间在A.C.Camargo癌症中心（ACCCC）根据Lauren分类诊断为弥漫型、肠型或混合型胃癌的435例患者的临床数据，另纳入来自巴西第二家癌症医院（Ceará癌症研究所–ICC）的8例患者。评估的临床数据包括发病年龄、其他原发肿瘤、肿瘤组织学、癌症家族史和既往种系基因检测。共115例患者符合应用于选择个体进行多基因遗传检测的临床标准，该标准基于比当前HDGC指南更广泛且限制更少的标准。简言之，患者符合以下标准之一即被纳入：（I）一至三级亲属中有两例胃癌，不论年龄，至少一例确诊为弥漫性胃癌（DGC）；（II）一至三级亲属中有两例胃癌，不论年龄（非弥漫型或组织学未知）；（III）DGC诊断年龄小于50岁；（IV）非弥漫型胃癌诊断年龄小于40岁；（V）胃癌（不论组织学类型和年龄）合并第二原发肿瘤（非黑色素瘤皮肤癌除外）。研究人员还对另外175例随机选择的胃癌患者进行了筛选，以检测在选定队列中发现的复发性致病变异。所有患者均签署书面知情同意书。本研究遵循赫尔辛基宣言并经ACCCC机构审查委员会批准。
关键技术方法方面，研究人员从外周血或唾液提取基因组DNA，对103例患者采用基于杂交捕获的Hereditary Cancer Solution panel（含26个基因）或定制panel（含27或113个基因）进行测序，另12例患者（占队列10.4%）获取外包商业诊断实验室的多基因检测结果。所用panel在超过一名患者中共享20个共同基因：APC、ATM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CHEK2、EPCAM、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、PALB2、PMS2、PTEN、RAD51C、RAD51D、STK11和TP53。CTNNA1仅包含在两个较大的panel中，共用于4例患者。在ACCCC检测的103例样本使用NextSeq 500系统（Illumina）测序，变异检出使用Sophia DDM软件或BaseSpace中的Enrichment插件完成，小变异VCF文件随后使用VarSeq软件注释和过滤。应用过滤标准包括最低质量评分≥30、测序深度≥30×、变异等位基因频率（VAF）≥0.25、次要等位基因频率（MAF）≤0.01或不存在于人群数据库（GnomAD、ESP、1000 Genomes和ABraOM），以及位于编码区或距外显子边界10个碱基对以内的内含子区域。选定变异随后使用临床数据库和计算机分类工具（ClinVar、VarSome和Franklin Genoox）评估，并依据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）和分子病理学协会（AMP）指南进行解读。CDH1分类遵循ClinGen CDH1变异解读专家小组建议。对41例患者（占队列35.6%）评估了拷贝数变异（CNVs）。对于175例不符合多基因panel检测标准的胃癌患者，研究人员采用二维DNA池策略筛选MUTYH（p.Gly396Asp和p.Tyr179Cys）和TP53（p.Arg337His）特定变异。DNA样本个体分配于96孔板，基于行和列进行等摩尔二维池化，每板生成8个行池和12个列池。每个DNA池使用QIAGEN Multiplex PCR Plus Kit进行多重PCR，PCR产物用于构建扩增子文库并在Ion Proton平台测序。当变异等位基因在超过0.5%的reads中检测到且最低覆盖深度为1000×时，样本判定为阳性。二维池化设计可精确识别每个变异阳性个体，阳性样本通过个体扩增子测序确认，变异等位基因在超过30%的reads中检测到时判定为验证。MUTYH变异负荷分析将特定MUTYH致病变异频率在选定遗传性胃癌队列与两个额外组之间比较：未选择胃癌患者和来自ABraOM数据库的对照人群（ABraOM SABE-WGS-1171对照队列包含来自巴西圣保罗基于人口普查样本的1171名老年人的全基因组）。统计分析使用描述性统计总结结果，分类变量采用Pearson χ2或Fisher精确检验，连续变量采用Mann–Whitney检验比较携带或不携带种系致病变异患者的临床特征，使用单侧Fisher精确检验计算比值比（ORs）和p值比较MUTYH变异频率，生存分析采用log-rank检验，p < 0.05认为具有统计学显著性，分析使用GraphPad Prism 6和R 4.5.0版进行。
研究结果方面，种系变异分析共纳入115例符合五项预定义临床标准之一的胃癌患者。大多数患者（79/115；68.7%）符合标准I（n = 34；家族中有两例胃癌，不论年龄，至少一例确诊DGC）或标准III（n = 45；DGC诊断年龄小于50岁）；全部79例患者基于其胃癌表型也符合2020 IGCLC标准。其余患者符合标准II（n = 17）、标准IV（n = 6）或标准V（n = 13）。队列平均年龄50.8岁，15%有超过一个原发肿瘤，44.3%有胃癌阳性家族史。根据Lauren分类，78例（67.8%）为弥漫型，25例（21.7%）为肠型，11例（9.6%）为混合型胃癌。多基因panel分析显示，15.7%（18/115）患者携带种系致病性或可能致病性变异（GPV）。GPVs在CDH1（5/115）、MUTYH（5/115）、TP53（4/115）、ATM（2/115）、CHEK2（1/115）和MLH1（1/115）中鉴定出。三种复发性变异占队列中鉴定GPVs的相当比例：MUTYH p.Gly396Asp（5例患者；4.3%）、TP53 p.Arg337His（4例患者；3.5%）和CDH1 p.Arg335*（3例患者；2.6%）。仅MUTYH变异在非癌症人群中相对常见（GnomAD中MAF 0.3%，ABraOM中0.7%）。CDH1和TP53变异在这些人群数据库中缺失。携带CDH1 p.Arg335*变异的三个先证者无已知家族关系，出生于巴西不同州：Ceará（家系图见图1C）、Piauí和Mato Grosso do Sul。CDH1 p.Arg335*（c.1003C>T）变异是位于外显子7的无义突变，预测导致蛋白质提前截短或无义介导的mRNA降解。既往研究的单倍型分析表明CDH1 p.Arg335*突变在两个家族中作为独立事件发生，排除了奠基者效应的可能性。该变异是明确的致病变异，此前已在日本、韩国、荷兰、瑞典和美国的多个HDGC家族中鉴定出。TP53 p.Arg337His是巴西奠基者变异，通常与乳腺癌风险增加相关。有趣的是，携带者家族中未观察到其他经典Li-Fraumeni相关肿瘤，尽管其中两个携带者有一个或多个亲属患胃癌，包括一个家族有5例胃癌。除标准IV外，符合所有纳入标准的患者中均鉴定出GPVs。在标准I分类的34例参与者中，7例（20.6%）携带GPV，代表队列中最高频率。标准II中3/17例（17.6%）为GPV携带者；标准III中6/45例（13.3%）；标准V中2/13例（15.4%）。符合标准IV的个体（6例）中未检测到GPVs。共检测到50个独特VUS。7个变异在7例患者中检出，位于先前与胃癌相关的常染色体显性癌症基因中，基于计算机预测（Revel>0.6）和既往发表提示可能的致病效应，被认为是值得关注的VUS。CDH1 p.Glu757Lys变异此前已被证明与E-钙黏蛋白的提前降解相关，导致蛋白质水平显著降低。对于CDH1 p.Gly761Ala，同一密码子在一项近期HDGC研究中与剪接改变相关。最后，对于CDH1 c.833-3C>G，SpliceAI预测剪接破坏的可能性高（评分0.55）。GPV携带者的临床特征比较显示，GPV携带者更常见近端肿瘤（贲门和远端食管），而非GPV携带者更常见远端（非贲门）肿瘤（p = 0.01）。男性携带GPV的百分比是女性的两倍，但差异无统计学显著性。总体而言，GPVs不影响其他临床特征包括组织学类型、原发肿瘤数量、幽门螺杆菌、胃癌或其他癌症家族史。生存分析显示GPV携带者与非携带者总生存无显著差异。在额外胃癌患者中筛查MUTYH和TP53时，考虑到115例高危胃癌患者中MUTYH和TP53基因复发性变异的高频率，研究人员试图在更大规模随机选择的胃癌受试者队列中研究这些变异的频率。该队列由175例不符合五项遗传检测标准中任何一项的胃癌患者组成。使用DNA池策略结合多重靶向NGS，研究人员评估了该扩展组中两种常见MUTYH致病变异（p.Gly396Asp和p.Tyr179Cys）和TP53奠基者变异（p.Arg337His）的频率。鉴定出另外2例MUTYH p.Gly396Asp变异携带者、2例MUTYH p.Tyr179Cys变异携带者和1例TP53 p.Arg337His携带者。随后将高危胃癌患者（n = 115）和全部胃癌队列（n = 290；115 + 175）中MUTYH变异的合并频率与巴西人群对照数据库（ABraOM）中的频率进行比较。在高危组中，MUTYH p.Gly396Asp携带者显示胃癌风险显著增加（OR = 4.4；95% CI 1.5–16.7），当考虑MUTYH p.Gly396Asp或p.Tyr179Cys任一携带者时该关联仍显著（OR = 3.1；95% CI 1.1–8.5）。然而，当分析扩展至全部290例胃癌患者队列时，效应量减弱且未达到统计学显著性（OR = 2.2；p = 0.06），尽管风险增加的趋势持续存在。
讨论部分总结如下：遗传性胃癌传统上在HDGC和CDH1致病变异框架内定义，而其他癌症易感基因（CPGs）的贡献仍特征描述不足。本研究应用拓宽且限制较少的临床标准，对巴西疑似遗传性胃癌患者进行多基因panel检测，在15.7%的病例中鉴定出种系致病变异（GPVs）。尽管CDH1仍是最常改变的基因（4.3%），但超过一半的GPVs在其他基因中鉴定出，包括MUTYH、TP53、ATM、CHEK2和MLH1。全部5例CDH1携带者符合2020 IGCLC检测标准。然而，携带其他基因GPVs的13例患者中有4例不符合这些标准，说明更广泛的临床选择结合多基因panel检测所捕获的额外发现。总体而言，本队列中观察到的GPV检出率与既往在胃癌患者中采用多基因panel或外显子组测序的研究一致，这些研究报告的频率在未选择或广泛确定的人群中约为6%至13%。在这些研究中，一组复发性基因（最突出的是CDH1、ATM、BRCA1/2、CHEK2和错配修复基因）作为胃癌易感性贡献者出现。在TCGA胃癌队列443例未选择病例中，8.8%的患者携带致病性或可能致病性种系变异，ATM和PALB2基于比值比分别为3.7和4.7被确认为胃癌相关基因。同样，来自日本生物银行的一项大型人群研究纳入10,426例胃癌患者和38,153例对照，发现27个CPGs中总体GPV患病率为3.7%，BRCA2、ATM、RAD51D、BRCA1、MSH6、PALB2、CHEK2、MLH1和MSH2是最常改变的。值得注意的是，该研究还显示幽门螺杆菌感染改变了同源重组基因变异相关的胃癌风险，表明与胃癌易感性相关的基因-环境相互作用。在最近一项涉及3,706例接受临床多基因panel检测的胃癌患者的回顾性研究中，13.3%携带GPVs，32.4%携带VUS。GPVs数量最高的基因是CDH1（18%）、ATM（11%）、BRCA2（10%）、CHEK2（8%）、BRCA1（7%）和MLH1（6%）。在2025年发表的另一项研究中，一个纳入750例早发性胃癌或有癌症家族史患者的多中心国际队列使用panel或全外显子组测序显示GPV检出率为6%。引人注目的是，该队列中仅35%的GPV携带者符合NCCN至少一种癌症易感综合征的遗传检测标准。检出率的差异可能反映了患者选择标准、人群遗传背景和基因panel组成的差异。在此背景下，本研究中观察到的较高检出率可能与基于扩展临床标准的高危个体富集有关。在非CDH1发现中，ATM一直被认定为胃癌易感性的中度风险基因。ATM功能丧失突变与胃癌风险增加的关联首先由Helgason等人在全基因组关联研究（GWAS）中证明，随后被多项研究证实。最近一项涉及4,607例ATM致病变异携带者的研究估计胃癌风险增加三倍（OR：2.97，95% CI 1.66–5.31）。在本队列中，ATM GPVs在2例具有不同组织学表现的患者中鉴定出，与先前提示表型异质性的观察一致。尽管种系ATM变异与中度增加的胃癌风险之间存在已确定的关联，当前指南不推荐仅基于ATM携带者状态进行胃癌特异性内镜监测或风险降低手术。幽门螺杆菌检测和根除的考虑应根据个人和家族史及其他风险因素个体化（NCCN遗传/家族高危评估：结直肠、子宫内膜、食管和胃癌V1.2026）。BRCA2变异的缺失（在其他队列中频繁报道）可能反映样本量限制或人群特异性因素。本队列中鉴定出1例CHEK2携带者。然而，支持种系CHEK2变异与胃癌之间关联的证据仍然有限且不一致，目前不足以确定风险大小或支持胃癌特异性监测建议。尽管胃癌不是Li-Fraumeni综合征的经典核心肿瘤，但其在TP53携带者中的发生已被越来越多地认识。在本研究中，所有TP53携带者均携带p.Arg337His变异，突显了考虑区域遗传背景的重要性。该巴西奠基者变异在南部和东南部地区相对流行（0.1–0.3%），与修饰的Li-Fraumeni表型相关，其特征为可变外显率和肿瘤谱外显率，包括胃癌。在携带TP53 p.Arg337His变异的5例患者中（4例在115例患者的主要队列中鉴定出，1例通过扩展队列中的靶向筛查鉴定出），3例为弥漫型胃癌，1例为混合型组织学，1例为肠型胃癌。在其他研究中，TP53携带者中弥漫型和肠型胃癌均有描述，但以肠型为主。单等位基因MUTYH变异对癌症风险的贡献仍存在争议。MUTYH编码一种参与碱基切除修复途径的DNA糖基化酶， specifically 纠正8-氧代鸟嘌呤引起的氧化DNA损伤。双等位基因MUTYH变异导致MUTYH相关息肉病（MAP），与结直肠息肉和癌高风险相关，但单等位基因变异的临床相关性不太明确。一些研究提示多种癌症风险增加，包括胃癌，而较大的病例对照研究未发现致病性MUTYH变异在多种癌症类型中显著富集，包括胃癌。在一项评估225例单等位基因MUTYH变异携带者的单一研究中，报告了多种癌症类型风险增加，包括胃癌，风险比为9.3（6.7–13）。在研究人员合并的290例胃癌患者队列中，9例携带杂合致病性MUTYH变异（7例p.Gly396Asp和2例p.Tyr179Cys，这是包括巴西在内的多个人群中最常见的两种致病等位基因）。p.Gly396Asp和p.Tyr179Cys均已在包括胃癌在内的不同恶性肿瘤个体中报道。然而，这些等位基因在一般人群中相对常见，且缺乏稳健、独立复制的证据证明单等位基因携带者癌症风险增加。在本队列中，高危患者中观察到复发性MUTYH变异的富集，在全部队列中风险增加趋势未达到统计学显著性。这些发现与 modest 效应量相符，应谨慎解读，强调需要更大规模研究以阐明单等位基因MUTYH变异的贡献及潜在基因-环境相互作用，特别是与幽门螺杆菌感染的相互作用。除明确致病性变异外，研究人员在胃癌相关基因中鉴定出若干优先关注的VUS，包括CDH1错义和剪接区域变异，计算机预测和功能数据提示可能的致病性，这说明遗传性癌症综合征中变异解读的持续挑战以及结合临床数据、功能分析和专家解读框架的协调努力的必要性。GPV状态与癌症或胃癌家族史之间缺乏统计学显著关联应谨慎解读。选择策略允许基于早发性疾病或第二原发肿瘤纳入，因此并非所有参与者都需要强家族史。小家庭规模、癌症诊断知识不完整、可变外显率和有限的GPV携带者数量也可能降低了研究人员检测组间差异的能力。本研究的另一个观察是位于贲门或远端食管的肿瘤患者中GPVs频率较高。这一发现可能反映肿瘤亚型之间的潜在生物学差异，因为胃食管交界处（GEJ）癌和近端胃癌已显示与非贲门胃癌相比具有不同的分子谱，包括更高的染色体不稳定性率和TP53改变富集。此外，来自Li-Fraumeni综合征的种系数据表明TP53致病变异携带者可能特别易患胃食管交界处肿瘤，新兴证据提示种系ATM变异对胃食管交界处腺癌肿瘤发生的贡献。在本队列中，所有携带TP53和ATM GPVs的患者肿瘤均位于这些区域，进一步支持需要研究基因组稳定性途径缺陷是否可能导致近端肿瘤易感性。本研究也存在局限性。回顾性、探索性设计、单国设置和有限的GPV携带者数量妨碍了遗传检测指南的定义或验证。基因内容、测序平台和拷贝数变异评估在患者间不完全一致。CTNNA1未包含在panel中，其他基因或变异类别的致病变异可能被遗漏或未被可靠检测。靶向MUTYH筛查仅限于两个复发性等位基因，可能低估了罕见致病变异的贡献。未进行肿瘤杂合性缺失或其他二次事件分析。此外，不完整的临床注释和随访数据限制了基因型-表型和生存分析的强度。总之，本研究扩展了巴西高危患者胃癌种系易感性的特征描述，揭示了超越CDH1的异质性易感基因谱，包括巴西TP53 p.Arg337His奠基者变异和中度风险基因如ATM，以及单等位基因MUTYH变异的提示性但非确定性贡献。在扩展选择标准中观察到的临床相关诊断产出支持在选定患者中考虑多基因种系检测，特别是在具有相关奠基者变异的人群中。这些发现提供了人群特异性证据，可能改善遗传性癌症易感患者的识别，并为旨在完善胃癌遗传检测策略的前瞻性研究奠定基础。研究结论翻译：在这个探索性巴西队列中，多基因检测揭示了超越CDH1的异质性GPVs谱，包括复发性TP53 p.Arg337His奠基者变异，强调了在考虑种系检测时进行全面肿瘤遗传学评估和人群特异性背景的重要性。
