《Human Genetics》：De novo SETD5 missense variants in individuals with MRD23 cluster within the protein’s SET domain
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SETD5基因的杂合性功能缺失（LoF）变异及包含SETD5基因的3p25.3缺失可导致常染色体显性遗传的智力发育障碍23型（MRD23）。研究人员报告了5例由SETD5错义变异导致的具有MRD23表型的患者。研究人员对携带新发SETD5错义变异的患者进行了研
SETD5基因的杂合性功能缺失（LoF）变异及包含SETD5基因的3p25.3缺失可导致常染色体显性遗传的智力发育障碍23型（MRD23）。研究人员报告了5例由SETD5错义变异导致的具有MRD23表型的患者。研究人员对携带新发SETD5错义变异的患者进行了研究，并通过全面的文献检索揭示了更多SETD5错义变异及LoF变异的报道。研究人员对错义变异的表型及蛋白定位进行了回顾分析，并与已报道的SETD5 LoF变异及3p25.3缺失进行了比较。研究人员还对SETD5错义变异的潜在影响进行了计算分析。通过Deciphering Developmental Disorders（DDD）研究数据库，在5个中心共鉴定出6例携带新发SETD5错义变异的患者；DDD数据库中另有4例携带错义变异的个体被报道。全面文献检索共发现12例携带错义变异的独特个体，以及104例携带LoF变异或3p25.3缺失的个体。其中一个变异p.Arg348Gln在3个无亲缘关系的个体中独立重复出现。所有携带可能致病性错义变异的患者均具有与MRD23一致的畸形特征、全面性发育迟缓（GDD）和孤独症，但除脑积水外未见重大先天性畸形，脑积水为观察到的新特征。心脏缺陷仅在LoF组中被报道。与散布于整个SETD5编码区的LoF变异不同，致病性错义变异局限于蛋白的SET结构域。研究人员证明SETD5中的致病性错义变异聚集于蛋白的SET结构域，这扩展了SETD5相关神经发育表型的突变谱，为改善出生后及产前遗传学诊断提供了框架。
研究背景方面，SETD5基因的杂合性功能缺失（LoF）变异及包含该基因的3p25.3缺失已被确认为常染色体显性智力发育障碍23型（MRD23，OMIM #615761）的致病原因。MRD23的临床特征包括不同程度的智力障碍（ID），伴或不伴孤独症谱系障碍、行为困难、学习困难、语言发育迟缓、畸形特征、先天性心脏缺陷及多指畸形等。既往报道的绝大多数SETD5 LoF变异为新发变异，仅有两个家系性病例报道。然而，截至目前，SETD5错义变异与神经发育表型之间的明确关联尚未建立，错义变异的致病性解读缺乏系统框架，这在临床遗传诊断中构成了显著的知识空白。研究人员首先在以色列Tel Aviv Sourasky大学医学中心通过诊断性三联体外显子组测序（ES）鉴定出2例携带新发SETD5错义变异的患儿，随后通过DDD研究数据库协作及全面文献检索，系统性地收集和分析SETD5错义变异携带者的临床与遗传学数据，旨在明确SETD5错义变异是否可导致MRD23表型，并探索其致病变异的蛋白结构基础。
研究人员开展了以下研究：通过DDD数据库和文献检索汇总SETD5错义变异携带者，并与LoF变异/3p25.3缺失携带者进行基因型-表型比较；利用多种致病性预测软件（REVEL、CADD、AlphaMissense）和保守性分析工具（GERP、ConSurf、Aminode）评估变异致病性；利用gnomAD数据库分析SETD5基因的错义变异约束情况；利用SWISS-MODEL和AlphaFold对SET结构域进行三维结构建模，并通过mCSM、SDM、DUET等服务器评估变异对蛋白稳定性的影响，利用APBS软件分析蛋白表面静电势。研究得出结论：SETD5致病性错义变异聚集于蛋白的SET结构域内高度保守且带正电荷的口袋区域，扩展了SETD5相关神经发育表型的突变谱和表型特征，为出生后及产前遗传学诊断提供了改善框架。
主要关键技术方法概括：研究人员采用诊断性三联体外显子组测序（ES）鉴定新发变异，通过DDD研究数据库（https://www.deciphergenomics.org/ddd/overview）和PubMed/Google Scholar文献检索组装研究队列，依据ACMG-AMP指南及ClinGen序列变异解读专家组建议进行变异分类，运用多种生物信息学工具进行致病性预测、保守性分析及蛋白三维结构建模与稳定性评估，并采用双侧Fisher精确检验进行组间临床特征频率比较。样本队列来源包括Tel Aviv Sourasky大学医学中心、DDD研究数据库及已发表文献。
研究结果方面，第一，SETD5错义变异携带者的临床与遗传学发现：共鉴定出22例携带SETD5错义变异的患者（16例变异位于SET结构域内，6例位于结构域外）。研究队列包含6例无亲缘关系的患者（年龄范围2.5~19岁），携带3种SETD5（NM_001080517.3）杂合新发错义变异：p.Ile387Thr（患者1）、p.Arg348Gln（患者2~4）、p.Gly344Asp（患者5）和p.Ser353Leu（患者6）；其中p.Arg348Gln在3例无亲缘关系患者中重复出现，其中1例患者的Episign甲基化谱与MRD23诊断一致（中等置信度）。患者2还携带ZBTB7A可能致病性变异（c.624_625del; p.Val209Glyfs*40），提示可能为双重诊断。DDD数据库中另有4例SET结构域变异报道，其中2例（p.Asn314Ser和p.Tyr391Cys）经SpliceAI预测影响mRNA剪接（评分分别为0.88和0.99），被视为LoF变异而排除后续分析。文献检索额外发现6个SET结构域错义变异，其中仅3例有足够临床数据。SET结构域内错义变异携带者（n=9）共享MRD23已描述的畸形特征，额外表型包括：早期语言和运动发育迟缓（8/9，89%）、肌张力低下（6/9，67%）、牙齿异常（5/9，56%）、孤独症（7/9，78%）及非多指性肌肉骨骼异常（7/9，78%）。脑积水（2/9，22%）为仅在错义变异队列中观察到的新特征。GDD/ID在错义变异携带者中报告率为89%（8/9），但研究队列中5例均为轻至中度。相比之下，LoF变异携带者中GDD/ID报告率更高（76/87，87%），而肌张力低下（38/87，44%）、孤独症（21/87，24%）和牙齿异常（13/87，15%）报告率低于错义变异携带者。心脏缺陷仅在LoF组中报告（27/87，31%）。基因型-表型比较显示，孤独症（p=0.002）、脑积水（p=0.008）、牙齿异常（p=0.011）和肌肉骨骼异常（p=0.013）达到统计学显著性，但经多重检验校正后仅孤独症仍显著（p=0.036），鉴于错义组样本量较小，结果需谨慎解读。
第二，致病变异聚集于SET结构域：SWISS-MODEL同源建模以SETD2结合H3K36M和SAH的晶体结构（PDB 5v22）为模板，QMEANDisCo Global评分为0.53±0.07，QMEAN4值为?3.71。鉴于SETD5的SET结构域为非经典结构域，与SETD2仅24%同源性，研究人员同时测试了AlphaFold预测结构，其QMEANDisCo Global评分略优（0.58±0.06），QMEAN4值为?2.61，故后续分析采用AlphaFold模型。结构分析显示，致病性LoF变异散布于整个SETD5编码区，而推定致病的错义变异局限于蛋白SET结构域。致病性及蛋白稳定性评估提示该结构域内大多数变异对SETD5蛋白结构及其与其他蛋白（如组蛋白或核酸）结合能力具有有害影响。结构分析揭示了SET结构域三维结构两侧平行分布的两个高度保守且带正电荷的口袋，带正电荷区域常形成负电荷配体、核酸的结合口袋或蛋白-蛋白相互作用界面；其中一个区域在SETD5中可能发挥H3K36组蛋白结合功能（与SETD2相似，PDB: 5v22）。尽管SETD5与SETD2的SET结构域序列同源性较低，但先前研究已表明其催化活性、SAM结合和底物识别所需的关键残基高度保守。所有分类为可能致病的变异残基均位于这两个平行区域内部。此外，研究队列中突变的两个氨基酸（Ile387和重复出现的Arg348）似乎与其他氨基酸（分别为Ser353和Asn345）形成氢键，而Ser353和Asn345的变异在研究队列或DDD数据库中也有报道。影响这些残基的任何变异均可能破坏氢键形成并损害三维蛋白结构组装。值得注意的是，p.Ser353Leu是唯一被预测对蛋白结构具有轻度稳定作用的变异，而所有其他变异均被预测为去稳定作用。gnomAD数据显示SETD5明显不耐受LoF变异（pLI=1），但错义变异约束不明显（Z评分为2.04，gnomAD 4.1）。LoF变异在整个基因中稀少，而错义变异在整个基因中相对常见，但在编码SET结构域的外显子中可观察到明显的错义变异匮乏。gnomAD 2.1.1的区域性错义约束数据进一步支持SET结构域编码外显子存在明显约束。Aminode氨基酸保守性分析显示SET结构域是整个蛋白中最保守的区域，ConSurf揭示了上述平行口袋的高度保守性。在SET结构域报道的变异（n=10）中，仅2个（20%）未达到ACMG可能致病性分类：p.Asp339Tyr被分类为意义不明变异（VUS），p.Arg283Gln被分类为可能良性。后者在gnomAD中有报道，位于SET结构域约束区域（Arg283-Asp390观察值/期望值：0.2029，p=1.762×10?1?）与非约束区域（Met269-Arg283观察值/期望值：0.8673，p=0.3）的交界处。与SET结构域内大多数变异不同，结构域外的所有变异（n=5）均被分类为VUS或可能良性。
讨论部分总结：本研究鉴定了SETD5基因SET结构域内一个特定的致病性错义变异聚集区，这些变异导致常染色体显性智力发育障碍MRD23。典型MRD23病例由散布于基因中的LoF变异导致，而本研究提示致病性错义突变集中于对蛋白功能至关重要的高度保守区域。SETD5基因编码SET结构域包含蛋白5，作为转录调控因子发挥作用。由于其包含保守的SET结构域，被认为通过介导组蛋白H3第36位赖氨酸三甲基化（H3K36me3）以及与HDAC3和PAF1相互作用来调控基因表达。虽然研究显示SETD5具有内在甲基转移酶活性，但也有研究认为其可能不作为经典甲基转移酶发挥作用，而是作为共抑制复合物（包括HDAC3、NCoR、G9a和PAF1）的支架。这些关键角色在发育中神经系统的神经祖细胞中尤为重要，可能驱动在敲除小鼠模型和SETD5 LoF变异患者中观察到的神经发育和孤独症表型。首例SETD5单倍剂量不足患者由Rauch等（2012）在一组非综合征性ID队列中报道，首个定义MRD23表型的SETD5患者队列由Grozeva等（2014）发表。此后，已有大量LoF变异或3p25.3缺失患者的描述（n=104），但错义变异在很大程度上被忽视。这在很大程度上并不令人意外，因为SETD5的pLI为1，而Z评分为2.04（gnomAD v4.1），提示该基因对LoF变异存在约束但对错义变异不存在约束。在此背景下，错义变异通常被认为不太可能导致严重疾病。本研究旨在定义和评估导致MRD23相关表型的错义变异，从而为这些患者的诊断提供框架。研究人员提供了编码蛋白SET结构域的区域显示出高错义约束（Arg283-Asn390观察值/期望值0.2029，gnomAD v2.1.1）相对于基因其余部分（大部分区域观察值/期望值>0.8673）的证据。通过比较患者数据并利用计算结构分析，研究人员区分了有害的SET结构域变异与可能良性或VUS变异，后者大多位于SET结构域外。结构分析揭示可能致病性错义变异聚集于SET结构域内两个高度保守且带正电荷的口袋中，其中一个可能为H3K36组蛋白结合所需；影响这些功能口袋内残基的致病性变异可能破坏正确的转录调控所需的三维组装和蛋白稳定性，驱动MRD23表型。临床上，在现有数据中，SET结构域错义变异携带者似乎显示出统计学上更高比例的孤独症、肌张力低下、牙齿异常和肌肉骨骼异常，常表现出比传统LoF变异或3p25.3缺失携带者更多的神经精神和行为问题；由于错义变异个体样本量较小，本系列中描述的这些差异应谨慎解读，需要在更大规模、统一协调的队列中加以确认，而非本研究中所采用的多来源汇总病例。值得注意的是，本研究引入脑积水作为与该变异类型相关的潜在新特征，该特征出现在2例个体中，扩展了SETD5相关疾病的已知表型谱。由于缺乏SET结构域外错义变异个体的足够临床描述，无法进行适当的表型比较。研究人员还发现了一个重复出现的变异（p.Arg348Gln），见于3例无亲缘关系患者，而同一位置的另一错义变异（p.Arg348Leu）此前已在Genomics England队列中发表。该Genomics England队列患者的HPO术语包括：眼部异常、牙缺失、漏斗胸、全面性发育迟缓、面部形态异常和轻度矮小，均不符合该患者被分配的疾病组（肾脏和泌尿道疾病），该患者被标记为未诊断；然而其表型与MRD23一致。重要的是，其中1例患者（患者4）具有与SETD5相关疾病对应的甲基化特征，为其致病性提供了功能证据。综上所述，这些发现进一步强化了这些变异的致病性，并确定Arg348残基为明显的致突变热点。在观察到的SETD5错义变异中，5个先前发表的变异位于SET结构域外：p.Arg77Cys（强迫症患者中）、p.Arg767Cys（Moyamoya病患者中）、p.Gly1045Ser（神经发育表型合并CAKUT患者中）、p.Lys698Arg和p.Thr727Ala（神经发育表型患者中）。与极为罕见的致病性变异不同，p.Arg767Cys、p.Arg77Cys和p.Thr727Ala在gnomAD和Franklin数据分析软件社区数据库中的未受影响个体中可观察到，且携带p.Thr727Ala的患者还被诊断为8p单体综合征和部分4p三体综合征。虽然p.Lys698Arg和p.Gly1045Ser确实未在任何数据库中发现，但其致病性预测较差。这凸显了它们与本研究中所有定位于SET结构域的可能致病性错义变异相比可能为良性或VUS的性质。需要注意的是，并非所有SET结构域变异都应被当然地解读为致病性，变异位置不应被自动视为因果关系的证据；相反，每个变异仍应依据标准国际指南进行仔细评估。将SET结构域定义为致病性错义变异的关键区域或热点区域， refined了对MRD23遗传架构的理解。这将允许更准确地解读SETD5变异，并有助于更好地分类先前被定义为VUS的变异。使用episignature检测对错义变异进行功能验证可提供变异因果关系的进一步证据。
研究结论翻译：总之，研究人员证明位于SET结构域的SETD5错义变异似乎导致MRD23。研究结果扩展了SETD5相关神经发育表型的表型特征和突变谱。尽管本研究缺乏功能实验来证明每个评估变异的因果关系或良性状态，但为改善出生后及产前遗传学诊断提供了框架。需要进一步描绘SETD5错义变异的临床谱以确立这些发现。
