《Med-X》：Bioengineering strategies for off-the-shelf, cell-based cancer immunotherapy
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肿瘤免疫治疗通过利用免疫效应细胞识别并清除恶性组织，重塑了现代肿瘤学格局。在细胞治疗策略中，过继性细胞疗法（adoptive cell therapy）——尤以嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）T细胞为代表——已在多种
肿瘤免疫治疗通过利用免疫效应细胞识别并清除恶性组织，重塑了现代肿瘤学格局。在细胞治疗策略中，过继性细胞疗法（adoptive cell therapy）——尤以嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）T细胞为代表——已在多种血液系统恶性肿瘤中实现高缓解率与深度缓解。尽管取得上述临床成功，其广泛推广仍受制于占主导地位的自体（autologous）制备范式，该范式与高昂的单例患者费用、延长的静脉到静脉（vein-to-vein）时间，以及起始物料与终产品质量的异质性相关，在经重度预处理的患者中尤为突出。通用型（off-the-shelf）策略旨在通过标准化细胞来源（如供者来源或可再生来源）或标准化用于编程免疫细胞的工程化试剂，提升可扩展性与可及性。本文综述了支撑三类互补性通用型平台的生物工程方法，包括同种异体（allogeneic）CAR T细胞、自然杀伤（natural killer, NK）细胞与恒定自然杀伤T（invariant natural killer T, iNKT）细胞疗法，以及体内（in vivo）CAR生成。最后，本文概述了通用型细胞治疗的临床转化前景，指出当前局限及未来生物工程与生产制造方向。总体而言，上述策略凸显了将塑造下一代广泛可及的细胞肿瘤免疫治疗的一致设计原则，包括免疫兼容性、可控性激活与可制造性。
引言
细胞肿瘤免疫治疗已改变临床肿瘤治疗格局。过继性细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中展现出前所未有的临床疗效，可实现深度乃至持久的缓解。自2017年美国食品药品监督管理局（FDA）批准首个CAR T细胞疗法用于儿童及年轻成人急性淋巴细胞白血病以来，多种CAR T细胞产品相继获批用于B细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤及多发性骨髓瘤等适应证。经典抗原识别中，T细胞经T细胞受体（TCR）识别由主要组织相容性复合体（MHC）提呈的肿瘤相关抗原；而肿瘤细胞常下调MHC-I表达以逃逸免疫识别，CAR由此被设计为不依赖MHC提呈的工程化合成表面受体，将抗原结合与强效胞内激活信号偶联，从而重定向细胞毒性。然而，占主导的自体离体（ex vivo）制备范式限制了可扩展性与可及性，促使发展可预先制备、标准化并按需给药的通用型产品。
现有临床CAR T治疗以自体为主，可降低移植物抗宿主病（GvHD）风险，但其离体制备为个体化多步骤流程：经白细胞分离术采集外周血单个核细胞（PBMCs），分离并筛选特定T细胞亚群，激活、基因修饰后扩增4至14天，再经严格质量控制后新鲜输注或冻存备用。该流程的主要局限包括：单例患者费用常超过40万美元；静脉到静脉时间可长达40天以上，期间疾病进展可降低完全缓解率；个体化生产导致终产品显著异质，且患者既往化疗、放疗等预处理可降低T细胞绝对计数并损害其功能，导致扩增不足与质检不合格，生产失败率可高达10%。此外，患者来源T细胞表型与功能质量显著影响CAR T的扩增、持久性与疗效，缓解者CAR T富集记忆相关基因表达，而无应答者上调耗竭标志物；CAR构建体设计与 prolonged 离体培养亦可塑造T细胞表型并促进耗竭。因此，自体CAR T疗效反映患者生物学、构建体设计与生产条件的综合作用。
上述挑战催生了对即用型、可扩展、广泛可及的通用型细胞免疫治疗平台的需求。原则上，通用型产品可由健康供者细胞大规模批次生产，或由诱导多能干细胞（iPSCs）等标准化可再生来源制备，从而降低生产时间与成本、提高产品一致性。本文以三个反复出现的设计瓶颈为框架比较不同平台：其一，供者来源T细胞产品须管控同种异体反应性与免疫排斥，后者可经免疫清除限制其持久性；其二，效应细胞内在生物学决定安全性与功能，NK细胞同种异体输注后GvHD风险固有较低，但常需工程化改造以改善体内持久性、迁移与激活，尤其在实体瘤中，iNKT细胞兼具低GvHD风险、类先天抗肿瘤活性及重编程免疫抑制性肿瘤微环境（TME）的能力，但其在PBMCs中频率低，治疗性扩增困难；其三，生产与物流影响可扩展性与治疗等待时间，促使将部分复杂性从细胞制造转移至靶向基因递送与表达控制的体内CAR生成策略。本文聚焦三类领先平台：同种异体CAR T细胞、NK与iNKT细胞疗法、体内CAR递送。
同种异体CAR T细胞治疗的生物工程策略
同种异体CAR T细胞疗法利用健康供者来源免疫细胞离体扩增，可生成标准化、即取即用的通用型产品，简化生产流程、降低成本、提高可及性并缩短等待时间。但非自身T细胞引入GvHD风险：输注T细胞表面TCR识别不匹配的宿主人类白细胞抗原（HLA）I类分子，导致对健康宿主组织的激活与损伤。此外，输注T细胞易被宿主清除，宿主T细胞可识别供者T细胞上的异源HLA分子并将其清除，即宿主抗移植物（HvG）反应，使同种异体CAR T持久性显著低于自体方法。因此，同种异体CAR T的核心生物工程挑战在于将CAR介导的肿瘤识别与内源性同种异体反应性解偶联，同时维持体内持久性。已报道策略主要归为两类设计理念：基因工程/编辑以消融TCR和/或HLA相关通路；非基因手段调控受体信号或抗原提呈，以较少永久性编辑降低同种异体反应性。
基因编辑方法
多种基因编辑策略被用于创建GvHD与HvG风险较低的同种异体CAR T细胞。首要步骤多为敲除TCR以防止CAR T细胞靶向健康组织。早期研究中，Torikai等利用锌指核酸酶（ZFNs）去除TCR α与β链恒定区，使T细胞无法经TCR识别宿主抗原；叠加靶向CD19的CAR后，可有效杀伤恶性B细胞并避免GvHD。后续研究进一步拓展，如Eyquem等通过将CD19特异性CAR转基因插入TCR α链（TRAC）位点破坏TRAC表达，使CAR表达受内源性TCR调控元件控制，获得更均一的CAR表达与更高 potency。TCR敲除CAR T已在B细胞恶性肿瘤人体临床试验中应用，多数患者应答且无GvHD。
TCR破坏可防GvHD，但同种异体CAR T仍易被宿主免疫系统清除。宿主T细胞可识别供者T细胞HLA I类分子错配并杀伤之。为此，研究者常敲除β2微球蛋白（B2M）表达。B2M为HLA I类分子组成部分，失活其编码基因使供者细胞无法表达HLA I类表面蛋白，从而逃逸宿主T细胞。Ren等利用CRISPR/Cas9同时破坏B2M、TCR与PD-1表达，发现敲除B2M足以生成HLA-I阴性CAR T细胞，联合其他基因修饰后体内同种异体反应性显著降低，且抗肿瘤疗效得以维持。然而，B2M敲除虽减少宿主T细胞识别，却使细胞暴露于NK细胞"缺失自我"识别与清除。为防NK识别，部分研究在基因编辑基础上引入抑制性NK受体配体HLA-E或HLA-G。HLA-E在缺失HLA I类分子的多能干细胞中表达时，可结合大多数NK细胞表达的NKG2A受体，阻止NK细胞应答。Jo等利用基因编辑破坏TRAC与B2M位点，同时插入CAR与HLA-E转基因，生成TCR与HLA I类缺陷且可规避NK细胞缺失自我识别的CAR T细胞；体外可逃逸活化NK细胞并维持抗肿瘤效力，在植入含NK细胞人PBMCs的免疫缺陷小鼠体内，NK细胞激活与清除显著低于HLA-E阴性CAR T细胞。
非基因编辑方法
除基因编辑外，多种非基因工程策略亦被探索以创建低同种异体反应性CAR T细胞，其降低多基因编辑带来的复杂性，侧重抑制而非彻底消除同种异体反应性受体表达。Michaux等采用非基因编辑方法干扰TCR组分CD3ζ，使输注的同种异体CAR T细胞无法触发GvHD：供者T细胞转导编码截短CD3ζ肽（T细胞抑制分子）的逆转录病毒载体，该肽整合入TCR复合物并阻断TCR激活信号，同时允许转导CAR组分激活；细胞表面仍表达TCR但不致GvHD，且体外体内均产生强效抗肿瘤活性。另一非基因编辑方法为利用小非编码RNA的RNA干扰破坏TCR。Rossi等采用基于短发夹RNA（shRNA）的多重系统沉默CD3ζ与B2M，以及CD28、CD95与CIITA：沉默CD3ζ与B2M减少GvH与HvG反应；CD28敲低进一步削弱TCR信号并限制过度T细胞激活；CD95沉默减少宿主免疫对供者CAR T细胞的靶向、提高持久性；CIITA调控HLA II类基因表达，敲低后HLA II类表达降低，进一步改善免疫逃逸与宿主内持久性。该多重RNA干扰策略无需直接基因组修饰即可精确控制T细胞激活。
上述多种同种异体CAR T生成策略已进入临床试验。UCART19为TRAC/CD52破坏的同种异体CD19靶向CAR T产品，早期试验纳入儿童与成人复发/难治急性淋巴细胞白血病患者，首次提供同种异体CAR T可无GvHD给药的临床证据。ALPHA/ALPHA2试验生成并使用CD19靶向同种异体CAR T细胞治疗复发/难治大B细胞淋巴瘤，报告总缓解率与完全缓解率分别为58%与42%，完全缓解中位持续时间23.1个月，无GvHD、免疫效应细胞相关神经毒性综合征或≥3级细胞因子释放综合征（CRS）病例。I期UNIVERSAL试验评估抗B细胞成熟抗原（BCMA）同种异体CAR T疗法ALLO-715治疗多发性骨髓瘤，总缓解率56%，毒性可控且无GvHD；入组后接受同种异体CAR T的中位时间仅5天，较典型自体CAR T时间线显著缩短。尽管结果鼓舞，其反映早期阶段条件，缓解持久性与同种异体CAR T长期持久性仍是活跃研究方向。
综合已报道的同种异体CAR T策略，在制造简便性、免疫兼容性与体内持久性之间存在一致权衡：最小编辑集（如仅TCR破坏）可显著降低GvHD风险并简化制造，但输注细胞常易受HvG免疫清除，限制持久性与耐久性；加入HLA I类消融（如B2M敲除）可减少T细胞介导排斥并改善持久性，但亦增加对NK细胞缺失自我识别与清除的易感性；引入HLA-E或HLA-G等抑制性配体可缓解NK介导清除，但增加工程步骤与产品复杂性，可能影响可扩展性与监管负担；非基因编辑方法（如显性负性信号组分或RNA干扰）可减少永久性基因组修饰并简化制造，但对同种异体反应通路的不完全或短暂抑制仍可能残留同种异体反应性或免疫识别，尤其在需长期持久性的情形。上述约束解释了为何耐久、普遍兼容的同种异体CAR T产品仍具挑战，并促使探索通过细胞内在生物学而非多基因工程降低同种异体反应性的效应细胞类型。
同种异体NK细胞疗法的生物工程
另一构建通用型免疫治疗的方法利用NK细胞天然靶向肿瘤细胞的能力。NK细胞为先天免疫系统细胞毒性组分，无需预先抗原致敏即可杀伤恶性细胞并招募其他免疫细胞，且较T细胞疗法CRS风险显著更低。从通用型角度看，NK细胞尤其具吸引力，因其激活不依赖抗原特异性TCR识别，同种异体输注后GvHD基线风险较供者T细胞产品大幅降低。同时，NK细胞疗法常面临独特生物学瓶颈：最突出为持久性有限、迁移与肿瘤浸润欠佳，以及TME内功能抑制，促使旨在增强耐久性与肿瘤 engagement 并保持良好安全性的生物工程策略。
NK细胞天然具抗肿瘤活性，早期多项临床试验尝试使用离体扩增的自体NK细胞治疗血液与实体肿瘤，发现自体NK细胞输注安全，但因NK细胞对癌细胞上自身MHC的识别，过继转移细胞抗肿瘤活性有限；且自体NK细胞疗法面临与自体T细胞部分相同挑战，既往化疗既耗竭NK细胞计数又损害其功能。因此转向同种异体NK细胞转移，细胞可来源于健康供者并预先制造。然而，同种异体反应性降低本身并不保证持久临床疗效，尤其在实体瘤中，过继转移NK细胞可表现为持久性有限、肿瘤部位迁移不足，以及在免疫抑制条件（如抑制性配体、可溶性抑制因子、代谢应激与TME缺氧）下功能减弱。因此，NK平台的主要生物工程目标并非主要"关闭"同种异体反应性（如同种异体CAR T），而是提高特异性与功能活性并改善体内耐久性。
应对上述约束的广泛探索策略为以CAR工程化NK细胞，实现抗原导向识别与细胞毒性。由于过继转移同种异体NK细胞GvHD风险低，CAR工程化NK（CAR NK）细胞可提供较同种异体CAR T细胞更安全的通用型替代方案，同时仍具可编程特异性。此外，CAR NK细胞保留天然CAR非依赖性肿瘤监视机制（如经内源性NK受体激活），在单一工程化靶抗原之外提供肿瘤识别冗余。尽管CAR研究主要聚焦CAR T细胞，多项研究已在多种肿瘤类型中证明CAR NK强效抗肿瘤效力，支持CAR NK作为可信的通用型平台。
