《Molecular Biomedicine》：Aerobic exercise preconditioning inhibits GSDME-dependent pyroptosis in myocardial ischemia–reperfusion injury through IGFBP2-AKT-PDCD4 signaling
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恢复缺血心肌的血流对组织存活至关重要，但血流恢复本身可造成额外损伤。线粒体功能障碍和焦亡（一种炎症性细胞死亡形式）参与再灌注损伤。尽管有氧运动具有心脏保护作用，但运动预适应如何通过循环信号维持线粒体功能并限制焦亡尚不清楚。本研究表明，胰岛素样生长因子结合蛋白2
恢复缺血心肌的血流对组织存活至关重要，但血流恢复本身可造成额外损伤。线粒体功能障碍和焦亡（一种炎症性细胞死亡形式）参与再灌注损伤。尽管有氧运动具有心脏保护作用，但运动预适应如何通过循环信号维持线粒体功能并限制焦亡尚不清楚。本研究表明，胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2）通过IGF-1R/PI3K/AKT信号通路及抑制程序性细胞死亡蛋白4（PDCD4）参与运动诱导的心脏保护。人类血浆蛋白质组学发现，具有持续有氧运动习惯的个体血浆IGFBP2水平升高；小鼠和原代心肌细胞实验将该通路与线粒体保护和减少gasdermin E（GSDME）依赖性焦亡相关联。缺血再灌注前进行12周运动方案可改善心脏功能并减小梗死面积，而全局Igfbp2敲除或心肌细胞特异性Igf1r缺失基本消除了这些保护效应。遗传学和药理学干预支持PDCD4抑制作为IGFBP2信号的下游机制。GSDME缺失减少细胞损伤，但未阻止PDCD4相关线粒体功能障碍，支持线粒体损伤位于GSDME激活上游的模型。这些发现将有氧运动响应的循环因子与线粒体保护及下游炎症性细胞死亡控制联系起来，推进了对运动诱导心脏韧性的机制理解。研究确定IGFBP2是这种保护的重要介质，而其他运动响应通路也可能参与其中。该通路为研究限制再灌注损伤的方法提供了理论依据，但其治疗相关性仍需进一步验证。
心血管疾病是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一，其中急性心肌梗死后的心肌缺血再灌注（ischemia–reperfusion，I/R）损伤是影响患者预后的关键因素。在中国当代ST段抬高型心肌梗死住院患者队列中，新发心力衰竭发生率为10.6%，并与短期死亡率增加相关。心肌I/R损伤是指冠状动脉闭塞后恢复血流时出现的矛盾性组织损伤。尽管再灌注对于挽救缺血心肌至关重要，但氧气和底物的突然重新引入会触发活性氧（reactive oxygen species，ROS）过量生成、钙超载、线粒体功能障碍及炎症反应，进而通过多种机制促进心肌细胞丢失。近年来，多种程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）形式被认定为心肌I/R损伤病理生理的关键机制。其中，焦亡（pyroptosis）作为一种炎症性程序性死亡形式，因其强效促炎作用和在加重心肌损伤中的作用而日益受到关注。研究人员既往研究表明，gasdermin E（GSDME）依赖性焦亡是I/R诱导心肌损伤的重要机制，其特征为GSDME的剪切。因此，靶向GSDME依赖性焦亡通路可能成为减轻心肌细胞I/R损伤的治疗策略。
有氧运动已被确立为改善心血管健康、降低心血管事件发生率和严重程度的有效非药物干预手段。在近期心肌梗死且左心室射血分数降低的患者中，参加结构化心脏康复与运动后收缩压和心率恢复改善相关。大量证据支持规律有氧运动可增强心肌对缺血性损伤的抵抗力并减轻I/R损伤程度。研究人员既往在《Molecular Medicine》发表的研究中，于I/R后1周开始有氧运动并持续8周，该I/R后运动方案可减弱GSDME依赖性焦亡并促进心脏恢复。本研究探讨运动预适应（定义为I/R前12周运动），重点关注循环IGFBP2如何参与PI3K/AKT-PDCD4信号以维持线粒体功能并限制GSDME依赖性焦亡。胰岛素样生长因子结合蛋白2（insulin-like growth factor-binding protein 2，IGFBP2）是一种多功能蛋白，参与细胞增殖、分化和凋亡的调控，并与多种疾病状态相关，包括心血管病理。研究人员既往研究提示，在恢复期IGFBP2通过调节焦亡和铁死亡在心肌I/R损伤中发挥保护作用。程序性细胞死亡蛋白4（programmed cell death protein 4，PDCD4）是一种促死亡因子，与线粒体损伤和应激信号相关。这些观察提示PDCD4可能参与心脏中GSDME活化和焦亡性细胞死亡的调控。
基于此背景，本研究旨在阐明有氧运动预适应减轻心肌I/R损伤的机制。具体而言，研究人员假设有氧运动诱导的循环IGFBP2上调激活IGF-1R/PI3K/AKT通路，导致Pdcd4表达下调，进而抑制Gsdme介导的焦亡。为验证该假设，研究人员整合了人类血浆和小鼠心肌蛋白质组学与遗传学及药理学干预，在互补的体内和体外I/R模型中开展研究。该研究发表于《Molecular Biomedicine》。
在技术方法方面，研究人员主要采用了以下关键技术：人类血浆非靶向蛋白质组学分析（纳入17名有规律有氧运动习惯的马拉松跑者与17名年龄和健康匹配的无规律运动史对照者，采集运动组基线、运动后即刻及运动后2周的血浆样本）；小鼠心肌组织非靶向蛋白质组学分析；12周跑台有氧运动预适应方案（每周一至周五每天55分钟，强度约50% VO?max）；左冠状动脉前降支结扎诱导的心肌I/R模型（缺血30分钟后再灌注）；原代新生小鼠心肌细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型（缺氧4小时、复氧2小时）；全局Igfbp2敲除小鼠和心肌细胞特异性Igf1r条件敲除（Igf1r-CKO）小鼠；AAV9介导的心肌细胞特异性Pdcd4过表达和敲低；腺病毒/慢病毒介导的体外Pdcd4过表达和沉默及Gsdme条件敲除；超声心动图、TTC染色、Masson三色染色、TUNEL染色、透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）、免疫印迹、免疫共沉淀、ELISA、Seahorse细胞外流量分析、JC-1染色、DCFH-DA/DHE活性氧检测、CCK-8细胞活力检测及PDCD4启动子荧光素酶报告基因实验等。
研究结果如下：
长期有氧运动预适应改善心肌I/R损伤并减弱GSDME依赖性焦亡。研究人员发现，12周有氧运动预适应可改善心脏功能（射血分数、短轴缩短率等）和心肺功能能力（VO?max），降低梗死面积与危险区面积比值（IS/AAR）及心肌纤维化，减少TUNEL阳性细胞，免疫印迹显示运动预适应后N-GSDME水平降低，cleaved caspase-1、N-GSDMD和NLRP3水平亦降低，IL-1β和IL-18水平下降，线粒体超微结构得以保留。这些发现支持运动预适应减弱GSDME相关焦亡信号，但并未确立对GSDME通路的排他性效应。
长期有氧运动增加循环IGFBP2水平。为鉴定介导有氧运动预适应心脏保护作用的候选运动因子（exerkine），研究人员对有无持续有氧运动的健康个体进行血浆非靶向蛋白质组学分析。结果显示，运动组VO?max和无氧阈值高于对照组，IGFBP2是 habitual aerobic exercise 个体中上调最显著的蛋白之一。ELISA证实运动组T1、T2、T3时点血浆IGFBP2浓度均高于独立对照组（均Holm校正P < 0.0001），运动组内重复测量分析显示总体时间效应显著（F(1.447, 23.150) = 3.799，P = 0.0498），但T1、T2、T3两两比较经Tukey校正后均未达统计学显著性。这些发现确定循环IGFBP2为运动响应的候选因子，可能参与运动诱导的心脏保护。
IGFBP2参与有氧运动预适应的心脏保护效应。研究人员对全局Igfbp2敲除（Igfbp2-KO）和野生型（WT）小鼠进行心肌I/R模型并给予或不给予上述有氧运动预适应方案。与EX + I/R组相比，Igfbp2-KO消除了有氧运动预适应的保护效益，表现为心脏功能恶化、VO?max降低、IS/AAR比值升高、心肌纤维化加重、GSDME依赖性焦亡增加，免疫印迹证实Igfbp2-KO小鼠血浆和心肌组织中IGFBP2水平显著降低，TEM显示Igfbp2-KO组线粒体超微结构破坏更严重。体外实验中，原代心肌细胞H/R时IGFBP2预处理可改善细胞活力并减弱GSDME依赖性焦亡，降低膜N-GSDME水平，减少PI阳性细胞（膜破裂），保护线粒体完整性和功能并抑制氧化应激。值得注意的是，心肌细胞特异性GSDME缺失可减轻H/R诱导的GSDME依赖性焦亡，但未明显改善线粒体损伤；IGFBP2在GSDME缺陷心肌细胞中仍继续保护线粒体，但未进一步减少GSDME依赖性焦亡。这些发现与线粒体保护位于GSDME激活上游的模型一致。
IGFBP2通过IGF-1R介导有氧运动预适应在I/R心肌中的保护效应。基于研究人员既往关于IGF-1R参与I/R后恢复期有氧运动益处的工作，研究人员进一步探讨IGF-1R是否也为运动预适应保护所必需。研究人员构建了心肌特异性Igf1r条件敲除（Igf1r-CKO）小鼠并进行心肌I/R伴或不伴运动预适应。免疫共沉淀显示IGFBP2与IGF-1R存在物理相互作用，且有氧运动预适应增强了该相互作用。功能上，心脏Igf-1r缺失和Igfbp2敲除均基本消除有氧运动预适应诱导的I/R损伤后心脏保护效应，表现为心脏功能恶化、VO?max降低、IS/AAR比值升高、心肌纤维化加重、TUNEL阳性率增加及IL-1β和IL-18水平升高。免疫印迹显示心脏Igf-1r缺失或Igfbp2敲除均增加N-GSDME、cleaved caspase-3和PDCD4表达。
有氧运动预适应激活PI3K/AKT通路并抑制PDCD4。为深入探究有氧运动预适应保护心肌免受I/R损伤的细胞内机制，研究人员检测了有氧运动相关的信号变化。对有氧运动小鼠心脏组织的非靶向蛋白质组学分析发现Pdcd4表达降低伴Pik3ca表达升高。免疫印迹证实体内EX + I/R组PI3K和AKT磷酸化增强伴PDCD4蛋白水平降低。此外，Igfbp2敲除和Igf-1r缺失均消除运动对PI3K/AKT磷酸化的上调作用。体外H/R原代心肌细胞中，IGFBP2预处理降低PDCD4水平并增加PI3K和AKT磷酸化，且在GSDME充足和缺陷细胞中均如此；Igf-1r缺失消除IGFBP2对PI3K/AKT磷酸化的上调。为检测PDCD4启动子活性，研究人员在HEK-293T细胞（异源细胞系）中使用PDCD4启动子驱动的萤火虫荧光素酶构建体pGL3-PDCD4 promoter进行报告基因实验，发现PI3K激活降低报告基因活性。这些发现支持IGFBP2依赖性激活IGF-1R/PI3K/AKT信号并抑制PDCD4。
IGFBP2通过激活PI3K/AKT抑制PDCD4以保护I/R后心肌线粒体从而抑制GSDME依赖性焦亡。为确定PI3K/AKT信号是否介导IGFBP2对PDCD4和GSDME依赖性焦亡的调控作用，研究人员在原代心肌细胞H/R前给予IGFBP2预处理并联合PI3K激动剂或拮抗剂。PI3K激动剂基本模拟IGFBP2的细胞保护效应，而PI3K拮抗剂显著削弱IGFBP2预处理的保护作用。具体而言，PI3K激动剂改善H/R后细胞活力的程度与 exogenous IGFBP2 相似，PI3K拮抗剂显著削弱IGFBP2诱导的活力增加。IGFBP2处理和PI3K激活降低TUNEL阳性率及N-GSDME和cleaved caspase-3水平，PI3K阻断逆转这些变化。此外，IGFBP2处理和PI3K激活保护H/R后线粒体功能，表现为氧消耗率（oxygen consumption rate，OCR）/氧化磷酸化活性改善、ROS积累减少及JC-1染色线粒体膜电位维持；相反，PI3K抑制基本逆转IGFBP2的线粒体和心肌保护效应。机制上，IGFBP2预处理和PI3K激动剂增加PI3K和AKT磷酸化并降低PDCD4，PI3K拮抗则逆转这些分子变化。为探究PDCD4是否作为IGFBP2下游调控GSDME依赖性焦亡，研究人员用重组IGFBP2预处理原代心肌细胞或通过腺病毒载体介导Pdcd4过表达或沉默。CCK-8结果显示IGFBP2预处理显著改善H/R应激下细胞活力，但该益处被Pdcd4过表达基本消除；相反，Pdcd4沉默在IGFBP2存在下恢复细胞活力。TUNEL阳性细胞在IGFBP2预处理后减少、Pdcd4过表达后增加、Pdcd4沉默后减少。免疫印迹显示IGFBP2预处理降低cleaved GSDME和cleaved caspase-3水平及PDCD4表达，增强PI3K和AKT磷酸化，这些效应被Pdcd4过表达逆转、被Pdcd4沉默恢复。线粒体实验表明IGFBP2有助于维持线粒体功能、减少氧化应激和保持线粒体膜电位，这些效应被Pdcd4过表达逆转、被Pdcd4沉默恢复。同时，IGFBP2预处理减少IL-1β、IL-18和LDH释放，这些保护效应被Pdcd4过表达消除、被Pdcd4沉默恢复。这些结果支持IGFBP2下调PDCD4并保护线粒体完整性从而限制下游GSDME活化和焦亡的模型。
GSDME缺失限制PDCD4相关细胞损伤但不恢复线粒体功能。为探究PDCD4诱导的线粒体损伤与GSDME依赖性细胞死亡之间的关系，研究人员在有或无GSDME缺陷的原代心肌细胞中调控PDCD4表达。H/R条件下，GSDME缺陷心肌细胞尽管存在PDCD4过表达仍保持细胞活力，细胞损伤也减少；然而，PDCD4相关线粒体功能障碍和ROS积累在GSDME缺失情况下持续存在。线粒体异常在细胞损伤减少情况下持续存在，支持线粒体功能障碍位于GSDME依赖性细胞死亡上游。这些发现支持PDCD4促进线粒体损伤和ROS积累、促进下游caspase-3介导的GSDME活化和焦亡的模型；在该模型中，IGFBP2-AKT信号抑制PDCD4并在GSDME激活上游保护线粒体。
有氧运动预适应通过IGFBP2/PI3K/AKT通路下调PDCD4以在体内抑制GSDME依赖性焦亡。为在体内验证这些调控机制，研究人员对Igfbp2-KO小鼠和WT小鼠进行心肌I/R损伤伴或不伴运动预适应，并使用AAV9载体调控心脏PDCD4表达。与体外发现一致，有氧运动预适应改善心脏功能和心肺表现，降低IS/AAR比值和心肌纤维化，抑制GSDME依赖性焦亡，减少心肌炎症因子IL-1β和IL-18释放。免疫印迹进一步显示有氧运动预适应增加p-PI3K和p-AKT水平，同时降低cleaved GSDME、cleaved caspase-3和PDCD4水平；这些分子变化在Pdcd4过表达或Igfbp2敲除情况下基本丧失。IGFBP2免疫印迹证实Igfbp2缺陷小鼠心肌IGFBP2水平降低。有氧运动预适应还保留线粒体超微结构；相反，Pdcd4过表达或Igfbp2缺陷消除这些保护效应，而Igfbp2缺陷小鼠中Pdcd4敲低部分恢复这些效应。这些数据支持有氧运动预适应诱导的IGFBP2通过PI3K/AKT抑制PDCD4、保护线粒体完整性并减少心肌I/R损伤中GSDME依赖性焦亡的模型。
讨论部分总结：心肌I/R损伤仍是急性心肌梗死后心脏功能障碍的主要原因。研究人员既往在《Molecular Medicine》的研究中，运动于I/R后1周开始并持续8周；本研究中小鼠在I/R前完成12周运动，因此使用"运动预适应"指代当前方案，"I/R后运动"指代既往方案。小鼠心肌非靶向蛋白质组学筛选鉴定PDCD4和PIK3CA为候选介质，运动后PDCD4丰度降低、PIK3CA丰度升高。主要进展在于整合人类血浆蛋白质组学证据（将持续运动习惯与较高循环IGFBP2联系起来）与IGFBP2-IGF-1R-PI3K/AKT-PDCD4通路的实验验证。数据支持IGFBP2-IGF-1R/PI3K/AKT信号抑制PDCD4从而保护线粒体完整性并限制下游GSDME活化的模型。在功能缺失实验中，GSDME缺陷心肌细胞尽管PDCD4过表达仍显示细胞损伤减少，而线粒体功能障碍和ROS积累持续存在，这种分离支持将PDCD4诱导的线粒体损伤定位在GSDME激活上游、GSDME作为焦亡性细胞死亡下游效应器的机制模型。焦亡作为促炎性程序性细胞死亡形式，日益被认为是心肌I/R损伤的关键机制。Gasdermin家族中GSDME是关键执行者，其剪切触发细胞膜孔形成和促炎细胞因子释放，加重组织损伤。既往研究将运动响应信号通路与心肌细胞存活和线粒体保护联系起来，包括研究人员关于I/R后恢复期IGFBP2-AKT-GSK3β-VDAC1信号和GSDME依赖性焦亡的工作。本研究通过鉴定IGFBP2-IGF-1R-PI3K/AKT信号下游的PDCD4抑制并将其与GSDME激活上游的线粒体保护联系起来，扩展了该机制。传统上，有氧运动的心脏保护益处归因于冠状动脉灌注改善、抗氧化能力增强、自噬调节和凋亡减弱。近期研究报道中等强度有氧运动抑制NLRP3炎症小体激活从而减轻I/R期间心肌细胞焦亡。本研究数据表明有氧运动预适应激活PI3K/AKT通路并下调PDCD4，与相关研究一致——Yang等表明有氧运动通过调节PI3K/AKT轴改善肥胖诱导的心肌焦亡和炎症。两项研究均强调PI3K/AKT信号在运动介导心肌焦亡调控中的核心重要性。本研究通过支持PDCD4促进线粒体损伤和ROS积累位于GSDME激活上游的模型，将有氧运动响应IGFBP2信号与线粒体保护和焦亡减少联系起来，扩展了这一认识。研究支持IGFBP2作为参与运动诱导心脏保护的重要介质，并显示循环IGFBP2相关增加。作为IGF-1的结合蛋白，IGFBP2在I/R损伤中的作用尚未像IGF-1那样被充分阐明。通过严格的体内外实验包括Igfbp2敲除模型，研究人员表明IGFBP2缺失消除了本小鼠模型中观察到的有氧运动预适应保护效应，而IGFBP2是下游激活IGF-1R/PI3K/AKT信号、抑制PDCD4及通过其线粒体完整性保护效应减弱GSDME依赖性焦亡所必需的。这些见解将IGFBP2定位为不仅是被动IGF-1调节因子，而是有氧运动预适应心肌响应中的主动参与者，为其作为治疗靶点提供了有力依据。Igfbp2敲除和IGF-1R缺陷实验支持IGFBP2-IGF-1R信号在所研究模型中对运动诱导心脏保护的贡献。然而，这些发现并未确立IGFBP2单独足以重现运动的全部心脏保护效应，其他运动响应通路也可能参与，其相对贡献及与IGFBP2信号的相互作用仍有待确定。本研究存在需进一步探索的局限性：人类蛋白质组学分析纳入小型仅男性队列，限制了对女性的推广；个体训练记录不完整限制了运动频率、单次时长及训练剂量与蛋白质组反应关系的评估；全局Igfbp2敲除证明本模型中运动诱导保护需要IGFBP2，但未鉴定组织来源或区分循环与局部产生IGFBP2的贡献，血浆IGFBP2升高因此不能确立循环IGFBP2为负责保护来源，需要组织特异性缺失和选择性救回实验来解析这些贡献；TUNEL检测DNA片段化并非焦亡特异性，不能区分焦亡与凋亡或其他细胞死亡形式，TUNEL阳性因此与GSDME剪切、膜相关N-GSDME、膜通透性测量及体外GSDME功能缺失发现一起解读，而非作为焦亡的独立证据，这些发现不排除共存细胞死亡通路；HEK-293T报告基因实验在异源系统中测量特定PDCD4启动子构建体活性，未确立心肌细胞中内源性PDCD4的直接转录调控；尽管研究人员描绘了IGFBP2-IGF-1R-PI3K/AKT轴，IGFBP2调控PDCD4表达的确切分子相互作用仍有待阐明；研究结果在啮齿类和原代心肌细胞中稳健，但需要在更大动物模型和临床队列中进一步验证以确定转化相关性；心肌I/R损伤涉及多种重叠的程序性细胞死亡形式包括凋亡和坏死性凋亡，未来研究应评估IGFBP2是否影响这些通路从而可能拓宽其治疗影响；此外，最大程度激活保护通路并最大程度实现I/R损伤后心脏保护所需的最佳有氧运动预适应方案仍有待系统确定。
研究结论翻译：本研究表明，长期有氧运动通过上调循环IGFBP2显著减轻心肌I/R损伤。该升高激活IGF-1R/PI3K/AKT通路，导致PDCD4下调并抑制GSDME依赖性焦亡。这些结果不仅完善了对运动介导心脏保护的理解，而且突出IGFBP2作为开发针对心肌I/R损伤新治疗策略的有前景靶点。
