《Neurochemical Research》：Rotigotine Attenuates Mechanical Hypersensitivity in 6-OHDA-Lesioned Rats: Associations with D2/D3 Receptors and Spinal Glial NF-κB/p65 Signaling
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疼痛是帕金森病（PD）一种致残性的非运动症状。本研究探讨了罗替戈汀（rotigotine）是否减轻偏侧帕金森病大鼠的痛觉超敏（异常性疼痛和痛觉过敏），并探索了D1/D2/D3受体的参与、胶质细胞中NF-κB/p-p65信号传导的调控以及脊髓TNF-α和IL-1
疼痛是帕金森病（PD）一种致残性的非运动症状。本研究探讨了罗替戈汀（rotigotine）是否减轻偏侧帕金森病大鼠的痛觉超敏（异常性疼痛和痛觉过敏），并探索了D1/D2/D3受体的参与、胶质细胞中NF-κB/p-p65信号传导的调控以及脊髓TNF-α和IL-1β的表达。PD模型通过向黑质致密部（SNpc）单侧注射6-OHDA诱导。采用von Frey纤维丝评估痛觉敏感性。采用免疫组织化学和免疫荧光分析SNpc和纹状体中的酪氨酸羟化酶水平、L5脊髓背角中GFAP、Iba-1和NF-κB/p-p65的表达，并采用ELISA测定腰段脊髓中TNF-α和IL-1β水平。急性（8 h）和亚急性（5天）经鼻给予罗替戈汀（0.1、0.5、0.75和1 mg/kg）均显示出抗异常性疼痛和抗痛觉过敏效应。这些效应可被选择性D2受体拮抗剂（L-741,626；14.6 nmol）和D3受体拮抗剂（nafadotride；3 nmol）阻断，但不受D1受体拮抗剂SCH-23,390（30 nmol）影响。亚急性罗替戈汀治疗与6-OHDA诱导的胶质细胞活化减少、NF-κB/p-p65表达降低以及脊髓TNF-α和IL-1β水平减弱相关。分子对接提示罗替戈汀与NF-κB的p65亚基之间存在潜在相互作用，且结合能良好。总之，罗替戈汀可改善PD相关疼痛，其机制可能通过D2/D3受体激活和神经炎症调控实现。这种推测的镇痛效应可能与抑制胶质细胞活化及抑制脊髓星形胶质细胞NF-κB/p-p65信号传导有关，从而可能减少后续促炎因子的释放。这些发现提示罗替戈汀可能成为管理PD感觉超敏的一种有前景的治疗选择。
帕金森病（PD）是一种常见的神经退行性疾病，疼痛是其最常见且致残性的非运动症状之一，影响约70–83%的患者。尽管疼痛在PD中发病率高且严重影响生活质量，但目前仍被低估且治疗不充分。越来越多的证据表明，PD促进胶质细胞过度活化和神经炎症反应，以肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）等促炎介质的释放为特征，这些介质参与痛觉超敏（包括异常性疼痛和痛觉过敏）的诱发和维持。在PD动物模型（包括6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁小鼠和大鼠以及1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）处理小鼠）的脊髓中，星形胶质细胞和小胶质细胞被活化。胶质细胞活化可通过中枢敏化和长时程增强等机制增强中枢神经系统兴奋性。在此背景下，核因子κB（NF-κB）信号传导尤为重要，因为它调控炎性细胞因子和其他参与持续性疼痛的介质的转录。值得注意的是，左旋多巴和普拉克索等多巴胺能药物已被报道可抑制纹状体和脊髓中的胶质细胞活化，支持抑制胶质细胞活化可能是PD相关疼痛的有效治疗策略这一观点。罗替戈汀（Ro）是一种对D3、D2、D1、D4和D5受体具有高亲和力的多巴胺激动剂，已被证明可减轻PD患者及实验性疼痛模型中的痛觉超敏。然而，其镇痛作用的机制仍知之甚少。目前尚不清楚哪种多巴胺受体亚型介导罗替戈汀在PD相关疼痛中的镇痛作用。阐明这一问题很重要，因为它可能从机制上将罗替戈汀与其他多巴胺激动剂区分开来，并有助于解释其治疗特性。近期研究表明，罗替戈汀载药微球在炎性疼痛模型中产生镇痛效应，这些效应主要通过D2/D3受体激活介导。同时，有报道称D2受体信号传导通过蛋白激酶B（Akt）/蛋白磷酸酶2A（PP2A）依赖途径抑制NF-κB活化从而抑制炎症，罗替戈汀也被证明可通过调控NF-κB信号传导减轻急性肝损伤。由于NF-κB是免疫反应和病理性疼痛的核心转录调控因子，罗替戈汀可能通过调控脊髓胶质细胞中的这一通路来缓解PD相关疼痛。因此，本研究探讨了罗替戈汀是否通过激活D1、D2或D3受体减轻6-OHDA损毁大鼠的触觉异常性疼痛和机械性痛觉过敏，以及这些效应是否与脊髓神经炎症减少和胶质细胞中NF-κB信号传导抑制相关。
研究人员开展了以下研究：研究背景方面，PD相关疼痛机制不明且治疗不足，罗替戈汀的镇痛机制尤其是受体亚型和脊髓神经炎症调控尚不清楚，因此需要开展本研究以明确罗替戈汀在PD疼痛模型中的作用及其与D2/D3受体和脊髓胶质细胞NF-κB信号传导的关联。研究结论方面，罗替戈汀通过D2/D3受体激活和调控神经炎症减轻PD相关疼痛，其抗痛觉超敏效应可能与抑制胶质细胞活化和抑制脊髓星形胶质细胞NF-κB/p-p65信号传导有关，进而减少促炎细胞因子释放，提示罗替戈汀可能是管理PD感觉超敏的有前景的治疗选择。重要意义在于首次系统表征了经鼻给予罗替戈汀在6-OHDA损毁大鼠中的抗异常性疼痛和抗痛觉过敏效应，并揭示了D2/D3受体及脊髓NF-κB通路在其中的作用。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：通过向左侧黑质致密部（SNpc）单侧注射6-OHDA（2 μL，8 μg/μL；总剂量16 μg）诱导偏侧帕金森病大鼠模型（雄性Wistar大鼠，来源为墨西哥城UAM-Xochochimilco的UPEAL）；采用von Frey纤维丝评估触觉异常性疼痛（up-down法测定50%缩足阈值）和机械性痛觉过敏（26 g固定强度纤维）；采用圆柱试验、阿扑吗啡诱导的旋转行为和旷场试验验证模型及评估运动功能；采用免疫组织化学检测SNpc和纹状体酪氨酸羟化酶（TH）水平；采用免疫荧光分析L5脊髓背角GFAP、Iba-1和NF-κB/p-p65表达；采用ELISA多重检测测定腰段脊髓TNF-α和IL-1β水平；采用分子对接分析罗替戈汀与NF-κB的潜在结合模式；采用Pearson区域相关分析评估NF-κB/p-p65与胶质细胞标志物的空间关联。
研究结果如下：
验证单侧6-OHDA诱导的帕金森病模型：通过阿扑吗啡诱导旋转试验、圆柱试验、旷场试验和TH免疫组化，得出单侧6-OHDA注射成功诱导帕金森病表型，表现为对侧旋转增加、双侧前肢同时使用减少、对侧前肢使用减少、运动活性降低以及SNpc和纹状体TH+神经元显著丢失（约80%）。
急性和亚急性（5天）经鼻罗替戈汀治疗在6-OHDA损毁大鼠中的抗异常性疼痛和抗痛觉过敏效应：通过von Frey纤维丝评估，得出急性经鼻罗替戈汀（0.1–1 mg/kg）剂量依赖性提高双侧后爪50%缩足阈值、减少250 mN纤维引起的缩足反应次数，峰值在给药后4 h，效应持续至少8 h；亚急性治疗（5天）持续发挥抗异常性疼痛效应（第4天达最大效能）和抗痛觉过敏效应（第1至5天显著，第4天最大）。
D2和D3而非D1多巴胺受体参与罗替戈汀诱导的抗异常性疼痛和抗痛觉过敏效应：通过选择性受体拮抗剂预处理结合行为学评估，得出D1受体拮抗剂SCH-23,390（3和30 nmol）不能逆转罗替戈汀的镇痛效应，D2受体拮抗剂L-741,626（14.6 nmol）部分逆转，D3受体拮抗剂nafadotride（3 nmol）显著逆转，拮抗剂单独给药对基线痛阈无影响，表明罗替戈汀的持续镇痛效应主要通过D2和D3受体激活介导。
罗替戈汀与NF-κB相互作用的计算机模拟分析：通过分子对接，得出罗替戈汀与NF-κB（PDB ID: 1NFI）p65亚基C端Rel同源结构域区域的理论结合模式，涉及Leu280、Gly247和Pro241的疏水接触，AutoDock 4.2和AutoDock Vina对接评分分别为?10.13 kcal/mol和?7.22 kcal/mol，CAPE作为计算参考化合物在同一区域显示相互作用，但该对接结果仅为预测性假设，需实验验证。
单侧6-OHDA损毁SNpc诱导L5脊髓背角胶质细胞活化和NF-κB/p-p65上调：通过免疫荧光和ELISA，得出6-OHDA损毁组同侧L5脊髓背角GFAP+星形胶质细胞、Iba1+小胶质细胞和NF-κB/p-p65+免疫反应性显著增加，主要分布于I–IV层，浅层I–II层更明显；区域Pearson相关分析显示NF-κB/p-p65与GFAP+星形胶质细胞强正相关（r = 0.6308），与Iba1+小胶质细胞呈负相关（r = ?0.1975）；脊髓TNF-α和IL-1β水平显著升高。
亚急性罗替戈汀治疗减少6-OHDA损毁大鼠L5脊髓背角胶质细胞活化、NF-κB/p-p65表达及TNF-α和IL-1β水平：通过免疫荧光和ELISA，得出罗替戈汀（0.5 mg/kg，经鼻，5天）显著减少GFAP+星形胶质细胞和Iba1+小胶质细胞数量，降低NF-κB/p-p65+免疫反应性；相关分析显示罗替戈汀使NF-κB/p-p65与GFAP+星形胶质细胞的信号关联完全解耦联（r = 0.0358），与小胶质细胞谱呈现强正相关（r = 0.6492），接近假手术组模式；罗替戈汀显著逆转6-OHDA诱导的脊髓TNF-α和IL-1β水平升高。
讨论部分总结：研究人员讨论了单侧6-OHDA损毁SNpc诱导运动缺陷，与文献报道一致；证实6-OHDA损毁诱导长期触觉异常性疼痛和机械性痛觉过敏；首次系统表征经鼻罗替戈汀急性和亚急性给药在6-OHDA损毁大鼠中的抗异常性疼痛和抗痛觉过敏效应，并与罗替戈汀微球在炎性疼痛模型中的镇痛效应及罗替戈汀透皮系统在PD患者中的镇痛临床证据进行比较；D2和D3受体介导罗替戈汀的镇痛效应，与罗替戈汀对D3/D2受体亲和力高于D1受体的药理学特征一致，脊髓背角D2受体主要分布于II–III层、D3受体最高密度位于浅层I–II层，提示局部D2/D3受体群体激活介导镇痛效应；罗替戈汀通过D2/D3受体激活可能不仅通过神经元机制还通过胶质细胞作用减少脊髓超兴奋性，D2受体刺激招募β-arrestin 2与PP2A和Akt形成大分子复合物抑制IKKα/IKKβ-IκB-NF-κB级联，以及CRYAB和NLRP3炎症小体等机制，但本研究未直接评估上游分子中间体如β-arrestin 2、NLRP3、CRYAB、PPP2R2C、PP2A和Akt；6-OHDA损毁增加L5脊髓背角胶质细胞活化、NF-κB/p-p65信号传导和TNF-α/IL-1β释放，NF-κB/p-p65与星形胶质细胞域强正相关而与小胶质细胞域负相关，浅层I–II层定位具有功能意义；分子对接提示罗替戈汀可能与NF-κB p65亚基结合，但仅为探索性计算筛选，不能证明直接结合或功能调控，需生物物理结合实验和功能研究验证；亚急性罗替戈汀减少胶质细胞活化和NF-κB/p-p65信号传导，使NF-κB/p-p65信号从星形胶质细胞域向小胶质细胞域转移，D2样受体经Gi蛋白偶联抑制腺苷酸环化酶、降低cAMP并调控下游炎症信号通路，支持罗替戈汀通过调控脊髓神经炎症减轻痛觉超敏的假说；研究局限性包括仅使用雄性大鼠、亚急性治疗仅5天，需长期研究评估药物耐受性、累积毒性和持续疾病修饰效应。
研究结论部分翻译：总之，这些数据表明单侧6-OHDA损毁SNpc与疼痛行为及脊髓神经炎症标志物变化相关，包括胶质细胞活化、L5背角NF-κB/p-p65免疫反应性和L4-L6脊髓细胞因子水平。急性和亚急性经鼻罗替戈汀治疗减轻机械性痛觉超敏，拮抗剂实验提示该反应可能部分由D2和D3受体调控。亚急性给药同时伴随星形胶质细胞和小胶质细胞活化、NF-κB/p-p65免疫反应性及脊髓细胞因子减少。总体而言，这些观察支持罗替戈汀抗痛觉超敏效应与脊髓神经炎症调控之间的潜在关联。然而，仍需进一步研究阐明精确机制并确定其与PD疼痛的相关性。最后，分子对接数据提供了初步假设，罗替戈汀与NF-κB之间的直接结合需要实验确认。
