基于AlphaFold2结构预测与分子动力学模拟的细菌L-天冬酰胺酶高特异性计算筛选及实验验证

《Pharmacological Reports》：Identification of highly specific bacterial L-asparaginase through genome-wide computational screening and experimental validation

　　

背景：细菌L-天冬酰胺酶（L-asparaginase）是治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）的关键药物，但其临床疗效受限于脱靶的L-谷氨酰胺酶（L-glutaminase）共活性，该共活性可导致严重副作用。本研究旨在鉴定具有最低L-谷氨酰胺酶共活性的高特异性细菌L-天冬酰胺酶。方法：研究人员采用整合AlphaFold2结构预测、分子对接、结合能估算和分子动力学（MD）模拟的工作流程，对约85,000个原核生物基因组进行了筛选。选取排名前六的酶进行实验验证。结果：来自Acidobacteriota sp.的RhAII蛋白对L-天冬酰胺（L-Asn）表现出高特异性，米氏常数（K_M）为12 ± 2 μM，转换数（k_cat）为34 ± 2 s^?1，且L-谷氨酰胺酶活性可忽略不计。分子动力学（MD）模拟揭示了酶活性与柔性门控元件（FGE）构象动力学之间的关系，该关系通过残基级均方根涨落（RMSF）表征，以及通过配体相对于蛋白质的均方根偏差（RMSD）评估的L-Asn位置涨落。高L-天冬酰胺酶活性与最佳FGE动力学和低L-Asn RMSD相关，这与底物在活性位点内的稳定定位一致。相反，相对于来自大肠杆菌（Escherichia coli）的参考EcAII酶，FGE动力学发生改变的酶，如来自Planctomycetota sp.的PoAII，表现出较差的L-天冬酰胺酶性能（K_M 5797 ± 1143 μM；k_cat 1.2 ± 0.1 s^?1）。结论：基因组和结构引导的筛选鉴定出RhAII作为有前景的抗白血病候选物，有待在生物模型中进一步验证。该计算工作流程的一个关键局限是预测的底物结合能与催化效率之间缺乏相关性，这突出了活性位点动力学在酶动力学中的重要性。

研究背景：L-天冬酰胺酶是治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）的重要临床酶类药物，其治疗原理是水解循环中的L-天冬酰胺（L-Asn），选择性诱导缺乏L-天冬酰胺合成酶（ASNS）的白血病淋巴母细胞凋亡。目前获批的治疗制剂仅基于来自大肠杆菌（Escherichia coli）的EcAII和来自菊欧文氏菌（Erwinia chrysanthemi）的ErAII两种II型L-天冬酰胺酶。然而，这两种酶均存在L-谷氨酰胺酶共活性，可导致神经毒性、肝毒性、胰腺炎和免疫原性反应等严重不良反应。尽管对L-天冬酰胺酶的结构和机制已有深入认识，但发现具有可忽略L-谷氨酰胺酶共活性和微摩尔级L-Asn特异性（K_M）的新酶仍然具有挑战性。传统微生物筛选方法耗时且主要依赖偶然发现，而此前的计算机优化研究受限于不完整的分类学采样和缺乏实验验证。因此，研究人员设计了一个高通量计算工作流程来鉴定具有潜在治疗相关性的新型L-天冬酰胺酶。

研究方法与结论：研究人员从基因组分类数据库（GTDB）release 08-RS214中检索了80,789个细菌和4,416个古菌物种的蛋白质序列，使用hmmscan对Class 1 L-天冬酰胺酶Pfam隐马尔可夫模型（HMM）谱（PF00710.23）进行筛选，鉴定出39,818个潜在的Class 1 L-天冬酰胺酶。利用AlphaFold2 v2.2.3预测同源四聚体结构，根据催化酪氨酸（Tyr）的位置和亚基来源区分I型和II型酶，鉴定出8,660个推定II型L-天冬酰胺酶。经过标准精度（SP）对接和MM-GBSA评估，保留453个预测L-Asn结合能优于EcAII的候选酶。随后通过诱导契合对接（IFD）和MM-GBSA重评分，排除含有害D90N突变的蛋白质后得到320个候选物。经结构聚类（Cα RMSD阈值1.0 ?）减少约60%冗余，选取15个代表进行三次独立100 ns分子动力学（MD）模拟，最终选定6个酶（GsAII、BbAII、KsAII、RhAII、AaAII、PoAII）进行重组表达和生化表征。此外，对6个候选酶进行了三次独立500 ns的长时MD模拟以表征FGE环动力学。研究结论表明，基因组和结构引导的筛选成功鉴定了RhAII，一种具有微摩尔级K_M、可忽略L-谷氨酰胺酶共活性且预测安全性 profile 与EcAII大体相似的髙特异性L-天冬酰胺酶，支持其进一步体外评估和优化。MD模拟揭示了FGE环柔性（通过RMSF谱测量）与L-Asn底物稳定性（通过RMSD谱评估）之间的关系，表明最佳环柔性结合稳定的L-Asn结合是区分高L-天冬酰胺酶活性酶的关键因素。这些见解将Class 1 II型L-天冬酰胺酶活性位点重新定义为由三个柔性环（FGE、L1和L2）组成的动态界面，为合理设计和工程化具有增强药理特性的下一代抗癌酶提供了坚实基础。

关键技术方法：研究人员采用的核心技术方法包括：（1）基于GTDB数据库的大规模基因组序列筛选，使用hmmscan对Pfam Class 1 L-天冬酰胺酶HMM谱进行检索；（2）AlphaFold2多聚体结构预测与基于催化Tyr位置和亚基来源的结构分类；（3）Glide标准精度（SP）分子对接与MM-GBSA结合能计算；（4）诱导契合对接（IFD）整合Prime精修以考虑活性位点柔性和催化相关水分子；（5）Desmond/OPLS4力场的分子动力学模拟（100 ns×3重复用于候选优先级排序）；（6）NAMD3/CHARMM36m力场的长时MD模拟（500 ns×3重复用于FGE环动力学表征）；（7）等温滴定量热法（ITC）的单注射（SIM）和多注射（MIM）模式测定酶动力学参数；（8）nanoDSF测定蛋白质热稳定性。样本队列来源为GTDB release 08-RS214（2023年4月）中80,789个细菌和4,416个古菌物种的蛋白质序列。

研究结果：

计算鉴定新型II型L-天冬酰胺酶：通过整合AlphaFold2结构预测、SP对接、IFD和MD模拟的分层筛选流程，从约85,000个原核生物基因组中鉴定出8,660个推定II型L-天冬酰胺酶，最终选定6个酶进行实验验证。AlphaFold2预测结构置信度高（平均pLDDT评分92），保留的AII模型催化Tyr位置与参考EcAII结构中观察到的闭合FGE环构象一致。

酶动力学与蛋白质热稳定性：6个排名靠前的酶均以可溶性形式在大肠杆菌中表达，产量从参考EcAII的1.5–3.5 mg/L至PoAII的35–50 mg/L不等。T_m值从42.39 °C（PoAII）至76.22 °C（BbAII）广泛变化。所有酶均水解L-Asn但K_M值不同，RhAII具有最低K_M（12 ± 2 μM），PoAII最高（5797 ± 1143 μM）。BbAII显示最高k_cat（135 ± 10 s^?1），AaAII最慢（k_cat 0.34 ± 0.04 s^?1）。RhAII具有最高催化效率（k_cat/K_M 2885 ± 526 s^?1mM^?1），与参考EcAII（3301 ± 704 s^?1mM^?1）相似。PoAII显示最高L-谷氨酰胺酶共活性（k_cat/K_M 18.2 ± 3.5 s^?1mM^?1），其对L-Gln的活性约为L-Asn的100倍。EcAII显示可检测的L-谷氨酰胺酶活性（K_M 3.0 ± 0.2 mM，k_cat/K_M 0.20 ± 0.02 s^?1mM^?1）。GsAII、BbAII和AaAII的L-谷氨酰胺酶活性接近检测限（0.01–0.03 s^?1mM^?1）。KsAII和RhAII由于高噪信比无法可靠测定动力学参数，表明共活性低于检测限。

EcAII活性位点结构与催化机制概述：EcAII为同源四聚体，每个活性位点包含五个保守催化残基：Thr12（主要亲核体）、Thr89、Tyr25、Asp90和Lys162。催化口袋入口由FGE、L1和L2三个环包围。底物结合诱导FGE从开放构象转变为闭合构象，精确 positioning Thr12和Tyr25。量子力学/分子力学（QM/MM）计算表明Thr12对底物Cγ原子的亲核攻击对应催化循环中的最高能垒，可能是限速步骤。

新型II型L-天冬酰胺酶的结构表征：所有6个测试AII酶均保留EcAII的四级结构。虽然整体四聚体折叠保守，但观察到连接N端和C端结构域的链接区位置存在微小差异。尽管存在这些变异，L-Asn水解关键残基Thr12和Tyr25在所有6个酶中结构保守，活性位点几何构型与EcAII密切相似。MD模拟（100 ns，三次重复）显示所有L-Asn-酶复合物稳定或中等稳定，RhAII和KsAII显示相对于EcAII参考的最低L-Asn RMSD profile。

新型II型L-天冬酰胺酶中FGE、L1和L2环的柔性：FGE在催化口袋附近显示最高的构象变异性。FGE闭合状态与相邻蛋白质区域相互作用，特别是与亚基B的L2环和亚基C的L1环。这些稳定闭合FGE构象的相互作用在6个AII蛋白间存在差异。基于MD模拟（500 ns，三次重复）的RMSF分析将FGE环内残基迁移率分为低（≤1.5 ?）、中（1.5–2.75 ?）和高（>2.75 ?）三类。BbAII和RhAII显示与EcAII最高相似性。KsAII也显示良好一致性但涨落幅度略低。AaAII和PoAII保留整体profile形状但显示较低RMSF值，表明环更刚性。GsAII显示增加RMSF幅度，表明增强的柔性。RMSD图显示KsAII和BbAII与EcAII最高相似性。AaAII和PoAII形成较低RMSD值组（均值3.8 ± 0.5和3.5 ± 0.6 ?），表明更刚性和稳定的构象。RhAII和GsAII显示较高RMSD值和较大标准差（均值4.3 ± 1.1 ?和5.1 ± 0.8 ?），表明增加柔性和降低稳定性。

新型II型L-天冬酰胺酶中的亚基相互作用：使用PDBePISA分析同源四聚体界面。虽然所有界面在研究蛋白中均保留，但亚基间相互作用数量不同。例如EcAII中A/B界面接触面积约2316 ?²，而PoAII中增至2532 ?²。A/D和A/C界面在所有分子中接触面积较小，分别范围为720–1168 ?²和625–696 ?²。

计算预测与实验底物特异性的验证：对接分析正确预测了整体底物偏好，PoAII显示显著更高的L-Gln催化效率，而其他测试酶基于催化效率优先利用L-Asn。然而，在L-Asn偏好酶中，来自对接的更有利L-Asn结合能和MD模拟中更高的配体稳定性并不一致对应更高的L-Asn催化效率。这些发现表明底物结合能可正确预测底物存在但不足以预测动力学参数即底物特异性。

RhAII药理特性的计算机评估：ProtParam分析预测RhAII和EcAII均为稳定蛋白，在哺乳动物网织红细胞中预测半衰期相同。ProsperousPlus分析表明两种蛋白对血浆相关蛋白酶切割的易感性大体相似，但RhAII显示略多的高置信度切割位点和独特切割位置。IEDB分析预测RhAII和EcAII的表位谱大体可比。RhAII具有略多的预测高亲和力MHC I类T细胞表位，而两种蛋白的预测高亲和力MHC II类表位数相似。RhAII未预测到线性B细胞表位，而EcAII获得一个阳性预测。相反，两种酶均预测到构象B细胞表位。

讨论部分总结：本研究通过全基因组计算机筛选结合实验验证，鉴定出RhAII为具有与临床用EcAII相当动力学特性但L-谷氨酰胺酶共活性可忽略的高L-Asn特异性II型L-天冬酰胺酶。在6个计算选择的候选酶中观察到底物特异性和催化效率的显著差异，表明仅有利的预测底物结合能不能可靠预测催化性能。动力学、结构和MD数据的比较表明高效L-Asn水解与FGE最佳动力学以及活性位点内L-Asn有限位置涨落相关。PoAII的对比特性进一步支持活性位点动力学在决定酶功能中的作用。关于高通量计算机筛选，对接成功预测了整体底物偏好，但对接评分和MD模拟中的配体稳定性与催化效率并不一致相关，表明底物结合有助于特异性但不完全决定催化性能。AF2建模的局限性通过基于Prime的结构精修结合IFD和结合口袋残基局部最小化得以克服。MM-GBSA方法估算底物结合自由能反映酶-底物复合物的热力学稳定性而非催化效率本身。RhAII的计算机分析表明其与EcAII在稳定性、蛋白水解易感性和免疫原性方面具有大体可比的安全性profile。此外，PoAII被鉴定为高效L-谷氨酰胺酶（K_M约449 μM），与人类血清L-Gln水平（约600 μM）密切匹配，为靶向L-Gln代谢的抗癌策略提供了有趣候选。研究结论：本研究证明高通量计算机结构引导的全基因组筛选方法有助于鉴定具有高L-Asn特异性和底物选择性的新型原核L-天冬酰胺酶。计算工作流程可用于鉴定底物偏好和优先排序候选L-天冬酰胺酶，但其预测催化效率的能力有限，突出了实验验证的必要性。MD模拟中观察到FGE环柔性（通过RMSF profile测量）与L-Asn底物稳定性（通过RMSD profile评估）之间的关系，表明最佳环柔性结合稳定的L-Asn结合是区分高L-天冬酰胺酶活性酶的关键因素。这些见解将Class 1 II型L-天冬酰胺酶活性位点重新定义为由三个柔性环（FGE、L1和L2）组成的动态界面，为合理设计和工程化具有增强药理特性的下一代抗癌酶提供了坚实基础。