《Virchows Archiv》：An IHC-based apoptotic priming profile from whole-slide imaging stratifies survival in venetoclax-based AML therapy
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以venetoclax为基础的治疗方案用于不适合强化化疗的老年急性髓系白血病（AML）患者，但该方案的预后生物标志物仍有限。本研究探讨了基于免疫组织化学（IHC）的BCL-2家族蛋白表达谱与接受venetoclax为基础治疗的老年AML患者临床结局之间的关联。
以venetoclax为基础的治疗方案用于不适合强化化疗的老年急性髓系白血病（AML）患者，但该方案的预后生物标志物仍有限。本研究探讨了基于免疫组织化学（IHC）的BCL-2家族蛋白表达谱与接受venetoclax为基础治疗的老年AML患者临床结局之间的关联。研究人员回顾性分析了2019至2023年在台北荣民总医院接受venetoclax为基础治疗的52例新诊断老年AML患者。通过IHC结合全切片成像（WSI）和数字化定量（QuPath）对诊断性骨髓活检标本中11种BCL-2家族蛋白进行评估，生成反映促凋亡与抗凋亡蛋白表达平衡的基于IHC的凋亡启动谱；表达水平采用Youden指数衍生的H-score截断值进行二分类。中位年龄为74岁，其中26.9%年龄≥80岁；76.9%根据ELN 2022标准具有不良风险细胞遗传学。在多变量分析中，年龄≥80岁（HR 2.46，p = 0.046）和ELN不良风险（HR 6.02，p = 0.004）独立预测死亡率。在多变量模型中，BH3-only蛋白BAD、HRK和NOXA的高表达与更长的总生存期相关，而抗凋亡蛋白BCL-XL和MCL-1的升高与更差的结局相关。这些发现提示，基于WSI的IHC凋亡通路表达谱可能为接受venetoclax为基础治疗的老年AML患者提供超出已确立的临床和细胞遗传学因素的额外预后信息。
研究背景方面，急性髓系白血病（AML）是一种起源于造血干细胞和祖细胞的侵袭性恶性肿瘤，主要影响老年人，中位诊断年龄约68至70岁。台湾地区年龄调整发病率约为2.4/10万，中位诊断年龄约60岁。老年AML患者结局较差，台湾地区老年AML患者的中位总生存期（OS）仅为5.1个月。凋亡抵抗是AML的标志性特征，BCL-2家族是内源性线粒体凋亡通路的核心调控因子。抗凋亡蛋白通过隔离促凋亡效应蛋白和BH3-only蛋白抑制细胞死亡。在AML中，BCL-2在原始细胞和白血病干细胞中频繁过表达，促进生存并导致治疗抵抗。venetoclax是一种选择性BCL-2抑制剂，临床试验表明venetoclax联合去甲基化药物（HMA）或低剂量阿糖胞苷（LDAC）可改善不适合强化化疗的老年AML患者的缓解率和生存。然而，对venetoclax为基础治疗的反应仍存在异质性，BCL-2家族蛋白表达在临床标本中的预后相关性尚未完全明确。临床结局可能反映促凋亡与抗凋亡家族成员之间的综合平衡。本研究利用全切片成像（WSI）结合自动化定量免疫组织化学（IHC），从多蛋白BCL-2家族panel生成基于IHC的凋亡启动谱，并评估其与接受venetoclax为基础方案治疗的真实世界老年AML患者队列中疾病进展和生存的关联。
研究人员开展了以下研究：回顾性分析52例新诊断老年AML患者（台北荣民总医院，2019年1月至2023年3月），所有患者均接受venetoclax为基础的治疗方案。通过IHC结合WSI和QuPath数字化定量评估诊断性骨髓活检中11种BCL-2家族蛋白的表达，生成凋亡启动谱。主要终点为无进展生存期（PFS），次要终点为OS。采用Cox比例风险模型评估基线变量与进展或死亡风险之间的关联。研究得出结论：全切片定量IHC分析BCL-2家族蛋白可为接受venetoclax为基础治疗的老年AML患者提供预后信息。高龄和不良细胞遗传学仍为关键风险因素，而基于IHC的凋亡启动谱提供了额外的分层信息。BCL-XL和MCL-1高表达与较差生存相关，而BAD、HRK和NOXA升高与较好结局相关。诊断时评估BCL-2家族蛋白可能有助于识别venetoclax治疗期间进展和死亡高风险患者，并可能为合理联合策略的设计提供信息。这些假设生成性发现值得在老年AML患者风险模型中对凋亡生物标志物进行前瞻性评估。重要意义在于，基于WSI的IHC凋亡通路表达谱可能为接受venetoclax为基础治疗的老年AML患者提供超出已确立临床和细胞遗传学因素的额外预后信息。
关键技术方法方面，研究人员采用回顾性队列研究设计，样本来源于台北荣民总医院2019年1月至2023年3月接受venetoclax为基础治疗的52例新诊断老年AML患者（年龄≥60岁），诊断性骨髓活检标本经B-5溶液固定后石蜡包埋（FFPE）。采用自动化免疫组织化学染色（Leica Bond-Max）检测11种BCL-2家族蛋白（HRK、BAD、NOXA、PUMA、BID、BCL-XL、MCL-1、BAX、BAK、BIM、BCL-2）。使用Hamamatsu NanoZoomer S210数字切片扫描仪以×40放大率进行全切片成像（WSI），应用QuPath version 0.5.0软件进行细胞检测、H-score计算和细胞分类。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析，结合Youden指数和最近原点法确定各蛋白表达的最佳截断值。采用Cox比例风险模型进行单变量和多变量分析，Kaplan-Meier法比较生存曲线。
研究结果方面，第一，研究人群临床特征：共分析52例老年AML患者，中位年龄74岁，26.9%年龄≥80岁，男性占59.6%。大多数患者（76.9%）ECOG评分为0至1分。根据ELN 2022系统，15.4%为预后良好，7.7%为中等，76.9%为不良风险。在低强度治疗亚组（占队列75.0%）中，ELN 2024风险分类为：良好51.3%、中等17.9%、不良15.4%、未知15.4%。诊断时38.5%患者骨髓原始细胞≥70%。第二，新诊断老年AML患者的结局预测因素：单变量Cox回归确定不良ELN 2022风险强烈预测较短PFS，骨髓原始细胞≥70%与较低的疾病进展风险相关。多变量分析中仅不良ELN风险保持显著。死亡率方面，单变量分析确定年龄≥80岁、不良ELN 2022风险和骨髓原始细胞≥70%为显著风险因素。多变量分析确认年龄≥80岁（HR 2.46，p = 0.046）和不良ELN风险（HR 6.02，p = 0.004）为死亡的独立预测因素。第三，BCL-2家族蛋白H-score与疾病结局：通过QuPath量化11种BCL-2家族蛋白的H-score，Youden指数确定的截断值为：HRK≥85、BAD≥215、NOXA≥220、PUMA≥110、BID≥200、BCL-XL≥35、MCL-1≥50、BAX≥70、BAK≥265、BIM≥110、BCL-2≥245。在疾病进展和死亡的单变量分析中，BAD和BCL-2高表达与风险降低相关，而BCL-XL和MCL-1高表达与风险增加相关。多变量分析中，HRK高表达为独立保护因素，BCL-XL和MCL-1高表达与风险增加的关联仅达边缘显著性。死亡率多变量分析中，BAD和HRK高表达为保护因素，BCL-XL高表达仍为显著风险因素，MCL-1高表达显示边缘显著性，NOXA高表达被确定为有利因素。第四，低强度治疗组的生存结局与BCL-2家族蛋白表达：在低强度治疗组中，BAD高表达在单变量和多变量分析中均与较长PFS一致相关。BCL-2高表达仅在单变量分析中与较长PFS相关，BCL-XL和MCL-1高表达在单变量模型中与较短PFS相关，MCL-1在多变量调整后显示边缘显著性。死亡率方面，BAD高表达与延长生存相关，MCL-1高表达在多变量分析中为显著风险因素。BCL-XL高表达在单变量分析中与风险增加相关，但多变量分析中不显著。第五，正常造血成分中BCL-2家族蛋白表达：在大多数AML骨髓活检标本中，正常造血成分被白血病原始细胞广泛替代，仅1例包含足够残留正常造血区域可供评估。在该可评估的正常骨髓样本中，BAK（2+）、BID（3+）和NOXA（3+）呈中至强表达，MCL1（1+）、PUMA（1+）、BIM（1+）和BCL2（局灶1+阳性）呈弱表达，淋巴细胞显示强BCL2表达并作为内阳性对照。BAX、BCL-XL、BAD和HRK在残留正常造血细胞中未表达。
讨论部分总结：本研究整合临床因素、ELN风险分层和基于WSI的定量IHC，阐明接受venetoclax为基础方案的老年AML患者的预后决定因素。在52例患者中，不良ELN 2022风险与较短PFS和OS相关，年龄≥80岁独立预测死亡。通过数字病理学量化诊断时11种BCL-2家族蛋白，发现促凋亡BH3-only蛋白（特别是BAD、HRK和NOXA）高表达与显著改善的结局相关，而抗凋亡蛋白BCL-XL和MCL-1过表达与较差生存相关。值得注意的是，BCL-2高表达在多变量调整后并非独立与改善生存相关，可能反映venetoclax对BCL-2功能的抑制作用。这些关联即使在低强度方案治疗患者中仍然明显。总体而言，BCL-2家族蛋白表达谱在venetoclax治疗队列中提供超出常规风险分层工具的额外预后价值。该真实世界老年AML队列中venetoclax为基础治疗的生存结局与关键试验报告相当。高龄患者生存显著较短，反映衰弱、合并症和治疗耐受性降低的影响。不良ELN遗传风险仍为强负性预后因素。BCL-2家族蛋白表达在塑造临床结局中的作用在本研究中尤为突出。BAD高表达与BCL-2和BCL-XL高亲和力结合，中和其抗凋亡功能并可能释放被隔离的激活因子触发凋亡。HRK和NOXA分别优先拮抗BCL-XL和MCL-1，其升高可能抵消BCL-2抑制期间的 resistance 通路。相反，BCL-XL和MCL-1高表达与风险增加相关，与其作为venetoclax耐药介质的角色一致。MCL-1在多变量模型中的边缘显著性可能与样本量较小有关。BCL-2家族蛋白的相对优势可能作为白血病细胞凋亡回路的功能代理。单例可评估残留正常造血区室显示促凋亡蛋白BAK、BID和NOXA中至强表达，结合抗凋亡蛋白弱表达，提示正常造血细胞处于相对凋亡启动状态，venetoclax抑制BCL-2可能进一步降低正常造血祖细胞的凋亡阈值，潜在导致venetoclax治疗期间常见的持续性血细胞减少。这些蛋白表达谱可能捕获上游基因组和表观遗传对凋亡回路的影响。TP53突变AML与更大BCL-XL依赖性分化状态相关，可能导致venetoclax反应不佳；IDH1/2或NPM1突变AML通常显示更大BCL-2依赖性。ELN 2022分类系统在预后判断中存在局限性，特别是在接受低强度治疗的患者中。2024年底ELN发布更新建议（ELN 2024）用于接受低强度治疗成人的遗传风险分层。在本队列中，ELN 2022不良风险组预测venetoclax为基础方案的较差结局，但在低强度亚组中ELN 2024风险分类未能预测结局。重要的是，BCL-2家族蛋白表达在调整ELN风险后保留预后价值，提示基于IHC的表达谱可能增加超出遗传风险分层的信息。本研究存在若干局限性：样本量相对较小限制统计效力，部分关联仅达边缘显著性；回顾性单中心设计可能引入选择偏倚；H-score评估仍为半定量方法；ROC衍生截断值来自本队列，应视为探索性；所有患者均接受venetoclax为基础治疗，无venetoclax非治疗对照队列，发现应解释为venetoclax治疗患者的预后关联而非预测性生物标志物。研究结论翻译：总之，全切片定量IHC分析BCL-2家族蛋白为接受venetoclax为基础治疗的老年AML患者提供预后信息。虽然高龄和不良细胞遗传学仍为关键风险因素，但基于IHC的凋亡启动谱提供额外分层。BCL-XL和MCL-1高表达与较差生存相关，而BAD、HRK和NOXA升高与较好结局相关。诊断时评估BCL-2家族蛋白可能有助于识别venetoclax治疗期间进展和死亡高风险患者，并可能为合理联合策略的设计提供信息。这些假设生成性发现值得在老年AML患者风险模型中对凋亡生物标志物进行前瞻性评估。
