《Journal of the Egyptian National Cancer Institute》：Artificial intelligence-driven precision immunogenetics for cancer stem cell-targeted CAR immunotherapy
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癌症干细胞（CSCs）因其自我更新能力、表型可塑性、免疫逃逸及治疗后持续存在的能力，是导致治疗耐药、肿瘤复发和疾病进展的主要因素。基于嵌合抗原受体（CAR）的免疫疗法已彻底改变了几种血液系统恶性肿瘤的治疗，但有效靶向CSC驱动的疾病，尤其是实体瘤，仍然充满挑战
癌症干细胞（CSCs）因其自我更新能力、表型可塑性、免疫逃逸及治疗后持续存在的能力，是导致治疗耐药、肿瘤复发和疾病进展的主要因素。基于嵌合抗原受体（CAR）的免疫疗法已彻底改变了几种血液系统恶性肿瘤的治疗，但有效靶向CSC驱动的疾病，尤其是实体瘤，仍然充满挑战。抗原异质性与丢失、CSC可塑性、CAR细胞功能障碍、代谢限制以及免疫抑制性肿瘤微环境（TME）可能限制长期治疗反应。诸如CD133、CD44、EpCAM、HER2、CSPG4、ALDH和EGFRvIII等CSC相关抗原已被作为CAR靶点进行研究，尽管它们异质性且依赖背景的表达引发了关于CSC特异性和脱靶/脱肿瘤毒性的重要担忧。人工智能（AI）和计算方法为整合基因组、转录组、蛋白质组、空间和临床数据提供了机会，可用于CSC相关抗原发现、生物标志物鉴定、CAR设计、患者分层和毒性预测。然而，支持这些应用的证据差异很大，从计算和临床前研究到回顾性临床建模不等，而AI引导的CSC靶向CAR疗法的前瞻性临床验证仍然有限。同样，下一代平台，包括CAR-自然杀伤（CAR-NK）细胞、CAR-巨噬细胞（CAR-M）、γδ CAR-T细胞和CAR-恒定自然杀伤T（CAR-iNKT）细胞，仍处于不同的转化发展阶段。本综述批判性地审视了CSC生物学、对CAR疗法耐药的机制、新兴CAR平台以及AI在精准免疫遗传学中的潜在作用。重点特别放在区分CSC内在性、CAR细胞内在性和TME介导的耐药性，并界定AI应用的证据成熟度。最后，讨论了当前在数据可用性、肿瘤异质性、模型偏差、外部验证、可解释性、安全性和前瞻性临床转化方面的挑战，以及开发经临床验证的、AI赋能的CSC靶向CAR疗法的优先事项。
引言
癌症仍是发病率和死亡率的主要原因，尽管手术、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗取得了进展。长期肿瘤控制的一个主要限制是癌症干细胞（CSCs）的持续存在，其具备自我更新、肿瘤起始能力、表型可塑性和对治疗应激的抵抗力。因此，CSCs被认为与实体瘤和血液系统恶性肿瘤的肿瘤进展、转移、治疗耐药和疾病复发有关。重要的是，CSC耐药不应被视为一种固定的表型。与干性相关的转录和表观遗传程序、细胞可塑性以及治疗诱导的状态转换，可使肿瘤细胞在疾病进展和治疗过程中获得或失去CSC样特征。这种动态行为使得稳定治疗靶点的识别变得复杂。
嵌合抗原受体（CAR）免疫疗法帮助免疫细胞独立于主要组织相容性复合体（MHC）呈递来识别细胞表面抗原，并已产生显著的临床获益，尤其是在血液系统恶性肿瘤中。CAR-T细胞疗法的成功随后推动了替代平台的发展，包括CAR-自然杀伤（CAR-NK）细胞、CAR-巨噬细胞（CAR-M）和其他工程化免疫细胞方法。然而，这些平台并非处于同等的发展阶段。CAR-T细胞拥有最强的临床证据，而许多替代平台仍处于早期临床或临床前开发阶段。因此，它们潜在的优点，包括不同的肿瘤识别、运输、持久性和与肿瘤微环境（TME）相互作用的机制，需要根据其各自的生物学和转化成熟度进行评估。
几种CSC相关抗原，包括CD133、CD44、EpCAM、HER2、CSPG4、ALDH和EGFRvIII，已在不同肿瘤类型中作为CAR靶点进行了研究。然而，CSC相关表达并不一定表明CSC特异性。表达可能在肿瘤类型、患者、肿瘤区域和细胞状态之间存在差异，同时一些被提议的CSC标记物也在正常组织或非CSC肿瘤群体中表达。因此，抗原异质性、抗原丢失、表型可塑性以及潜在的脱靶/脱肿瘤毒性仍然是长期CSC导向CAR疗法的主要障碍。这些局限性在实体瘤中尤为重要，因为受限的运输、基质屏障、缺氧、代谢压力和免疫抑制性免疫群体进一步降低了CAR细胞的活性。
因此，耐药性源于多个相互作用的部分，而非仅仅来自CSCs。CSC内在机制包括干性相关信号传导、表型可塑性和抗原表达的适应性变化。CAR细胞内在机制包括受损的持久性、慢性抗原刺激、代谢功能障碍和T细胞耗竭。同时，TME可通过癌症相关成纤维细胞（CAFs）、细胞外基质重塑、缺氧、抑制性髓系群体、调节性T细胞和抑制性信号通路来限制免疫细胞的浸润和功能。区分这些机制对于确定治疗策略应修改CSC靶点、CAR细胞状态还是周围微环境至关重要。
人工智能（AI）和计算方法为整合基因组、转录组、蛋白质组、单细胞、空间、影像和临床数据提供了机会，用于生物标志物发现、患者分层、抗原优先排序和CAR工程化。这些应用的转化成熟度差异很大。计算靶点预测、临床前建模、回顾性临床预测和前瞻性临床验证代表了不同的证据水平，不应被视为等同。因此，对免疫治疗反应的预测并不能证明某个AI模型已经前瞻性地设计了一个有效的CSC靶向CAR产品。
因此，本综述根据三个相互关联的领域评估CSC靶向CAR免疫疗法：CSC内在生物学、CAR细胞内在功能和TME介导的耐药性。它还根据证据和验证阶段审视AI应用，重点强调计算发现、实验或临床前验证、回顾性临床建模和前瞻性临床效用之间的区别。本综述还考虑了CAR-T、CAR-NK、CAR-M、γδ CAR-T和CAR-恒定自然杀伤T（CAR-iNKT）平台在生物学功能、制造、临床成熟度和转化潜力方面的差异。最后，在开发经临床验证的、AI赋能的CSC靶向CAR疗法的背景下，考虑了临床实施的主要障碍，包括CSC特异性数据集稀缺、肿瘤异质性、模型偏差、批次效应、外部验证、可解释性、安全性和监管问责制。
用于CSC靶向免疫治疗的CAR平台
CSCs是CAR疗法的重要靶点，因为它们的持续存在导致了肿瘤再生、治疗耐药和复发。CAR平台提供MHC独立的抗原识别，但它们针对CSCs的有效性受到抗原异质性、CSC可塑性、有限的持久性和TME介导的抑制的限制。现有的CAR平台在临床成熟度、生物学功能和制造可行性方面差异显著。CAR-T细胞拥有最强的临床证据，而CAR-NK、CAR-M、γδ CAR-T、CAR-iNKT和CAR工程化中性粒细胞仍处于较早的开发阶段。
CAR-T细胞
CAR-T细胞仍然是临床上最先进的CAR平台，在几种血液系统恶性肿瘤中已确立疗效。其MHC非依赖性识别是有利的，因为MHC-I表达降低可能导致免疫逃逸。已作为CAR-T疗法靶点进行研究的CSC相关抗原包括CD133、EpCAM、CD44v6、CD123、HER2和EGFR变体。然而，靶向单一抗原可能不足，因为抗原丢失、异质性表达和谱系可塑性可能允许残留肿瘤群体的存活。持续的抗原暴露、抑制性信号传导和代谢压力也会损害CAR-T细胞的功能。重要的是，抑制性受体的表达增加不应自动等同于不可逆的终末耗竭；耗竭代表了一种更广泛的功能和转录状态，涉及持续刺激、分化改变、代谢功能障碍和效应能力降低。因此，下一代CAR设计可能会延迟或减少功能障碍，但不应对其完全阻止耗竭抱有假定。双靶点、串联和逻辑门控CAR设计可能比单抗原靶向减少抗原逃逸，但增加的靶向广度并不能消除与异质性抗原表达或正常组织表达相关的风险。因此，CAR-T疗法目前为CSC导向的临床转化提供了最强有力的平台，但有效的CSC根除仍依赖于适当的靶点选择以及对肿瘤和CAR细胞耐药机制的控制。
CAR-NK细胞
CAR-NK细胞将CAR依赖性抗原识别与先天细胞毒性机制相结合，并且由于与常规同种异体T细胞方法相比移植物抗宿主病（GVHD）风险较低，在同种异体制造方面可能具有优势。其潜在优势包括降低细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性的风险，以及开发标准化现货型产品的可能性。然而，体内持久性有限仍然是一个主要局限。已研究了诸如IL-15表达和CISH缺失等策略来改善CAR-NK的存活、代谢适应性和细胞毒活性。NK细胞活性也受TME影响：细胞因子和生长因子网络可将NK细胞重编程为功能失调或免疫调节状态，因此不应假设先天细胞毒性在每个肿瘤环境中都保持完整。尽管CAR-NK细胞在安全性和制造方面可能具有优势，但其长期的CSC根除效果在临床上尚未像CAR-T疗法那样得到充分证实。
CAR-巨噬细胞
CAR-M细胞为实体瘤提供了一种独特的生物学方法，因为巨噬细胞可以浸润肿瘤组织、吞噬恶性细胞、修饰TME并参与抗原呈递。这些特性可能尤其适用于CSC富集的实体瘤，在这些肿瘤中，CAR-T细胞浸润不良和基质屏障限制了治疗活性。然而，CAR-M疗法在临床上的验证程度远低于CAR-T疗法。因此，其潜力应在肿瘤浸润、吞噬活性、TME重塑和抗原呈递的背景下考虑，而不是作为CAR-T细胞的既定替代品。
γδ CAR-T细胞
γδ CAR-T细胞结合了CAR介导的抗原识别与γδ T细胞的固有肿瘤识别特性，后者可以在没有传统肽-MHC限制的情况下识别细胞应激相关信号。这可能会拓宽肿瘤识别范围，并为靶向异质性疾病提供额外途径，尽管γδ亚群在表型、组织分布和功能行为上有所不同。对CAR-γδ T细胞开发的综述描述了令人鼓舞的临床前发现，但强调制造、持久性、功能一致性和临床证据仍然是重要的局限性。它们针对特定CSC群体的有效性尚未在临床上确立。
CAR-iNKT细胞
CAR-恒定自然杀伤T（CAR-iNKT/CAR-NKT）细胞结合了CAR依赖性抗原识别与恒定T细胞受体（TCR）识别以及先天性样效应功能。与传统αβ T细胞不同，iNKT细胞具有受限的恒定TCR，可以识别CD1d呈递的脂质抗原；这种生物学特性除了CAR导向的肿瘤杀伤外，还可能允许识别肿瘤微环境（TME）中选择性的免疫抑制性CD1d阳性细胞。近期的临床前研究已证明了针对卵巢癌、CD70阳性肾细胞癌、间皮素阳性三阴性乳腺癌和EGFRvIII阳性胶质母细胞瘤的同种异体、造血干细胞和祖细胞（HSPC）衍生的CAR-NKT平台。在这些模型中，肿瘤杀伤涉及CAR和/或NK受体介导的活性，而对CD1d阳性细胞的TCR介导识别为修饰TME提供了潜在手段。HSPC衍生方法也为现货型制造提供了一条可扩展的途径，并且与传统的同种异体αβ T细胞相比，可能降低同种反应性和GVHD风险。这些发现是强有力的，但仍主要是临床前的；引用的研究并未建立临床疗效或长期的CSC根除。因此，生物学原理应与已证实的临床获益区分开来。
CAR工程化中性粒细胞
CAR工程化中性粒细胞代表一个新兴平台，能够快速迁移至发炎的肿瘤组织。因此，其潜在优势主要与肿瘤运输有关，而非已确定的CSC特异性细胞毒性。支持其在CSC靶向治疗中应用的证据仍主要是临床前的。
比较性转化视角
因此，主要的CAR平台应根据生物学机制和开发阶段加以区分，而不是作为等效的替代方案呈现。CAR-T细胞具有最强的临床验证，但仍受限于抗原逃逸、耗竭以及在许多实体瘤中活性不佳。CAR-NK细胞在同种异体制造和安全性方面具有潜在优势，但仍受持久性限制。CAR-M细胞可能特别适用于实体瘤，因为它们具有浸润、吞噬和TME重塑能力，尽管临床证据仍然有限。γδ CAR-T和CAR-iNKT细胞提供了额外的MHC非依赖性免疫功能，但仍处于较早期的临床开发阶段，而CAR工程化中性粒细胞则主要是临床前的。因此，目前没有一个单一的CAR平台能为CSC根除提供通用解决方案。平台选择应考虑CSC抗原分布、肿瘤可及性、TME特征、预期持久性、制造要求、同种异体可行性以及必须解决的具体耐药机制。
