《Neurology Genetics》：Sickle Cell Trait and Incident Ischemic Stroke Risk: A Whole-Genome Sequencing Study in the All of Us Research Program
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背景与目标：镰状细胞特质（SCT），即杂合血红蛋白变异（HbAS）基因型，影响全球约3亿个体及美国8–10%的黑人/非裔美国人。既往探讨SCT与缺血性卒中关联的研究结果相互矛盾，效应估计从无关联到风险增加2倍以上不等。文献解读受限于样本量偏小、祖先多样性有限及
背景与目标：镰状细胞特质（SCT），即杂合血红蛋白变异（HbAS）基因型，影响全球约3亿个体及美国8–10%的黑人/非裔美国人。既往探讨SCT与缺血性卒中关联的研究结果相互矛盾，效应估计从无关联到风险增加2倍以上不等。文献解读受限于样本量偏小、祖先多样性有限及对遗传祖先调整不充分。因此，研究人员在All of Us（AoU）队列中评估了经全基因组测序（WGS）确认的SCT在调整遗传祖先和血管危险因素后是否与缺血性卒中发病独立相关。方法：研究人员利用NIH AoU受控层级数据集Curated Data Repository第8版（CDR v8，C2024Q3R9）中414,830名参与者的WGS确认血红蛋白β亚基（HBB）基因型rs334（HBB NM_000518.5:c.20A > T [p.Glu7Val]）开展回顾性队列研究。在限定于具有WGS数据、可用电子健康记录数据、年龄18–75岁、至少12个月随访且队列入组时无既往卒中或短暂性脑缺血发作（TIA）的合格参与者后，275,530名参与者构成缺血性卒中发病队列。研究人员采用多变量Cox比例风险模型比较杂合HbAS SCT参与者与纯合参考HbAA参与者缺血性卒中发病风险，并调整年龄、性别、高血压、糖尿病、心房颤动、慢性肾脏病（CKD）、体质指数（BMI）、吸烟及源自AoU预计算WGS祖先流程的遗传祖先主成分1–10。次要分析包括竞争风险建模、患病卒中的多变量logistic回归、所有次要结局的Cox模型、5项检验主要发现稳健性的敏感性分析及12项预设亚组分析。结果：在275,530名参与者贡献的3,374,790人年随访（平均随访12.25年）中，5,876名为杂合HbAS SCT，269,404名为纯合参考HbAA，144名为纯合变异HbSS镰状细胞病。HbAS与HbAA的粗缺血性卒中发生率分别为1.15/1000人年与0.67/1000人年（粗率比1.70）。多变量调整后，SCT与缺血性卒中发病无显著关联（风险比[HR] = 1.06；95%置信区间[CI] 0.89–1.25；p = 0.53）。结果在所有12项预设亚组、5项敏感性分析及评估结局定义、协变量时序和祖先限制稳健性的额外缺失数据和时间依赖协变量分析中一致，包括非洲遗传祖先亚组分析（HR = 0.97，95% CI 0.81–1.16）、限定于非洲遗传祖先参与者的单独敏感性分析（HR = 0.98，95% CI 0.82–1.17）及严格基线协变量定义（HR = 1.09，95% CI 0.92–1.29）。竞争风险建模（HR = 1.06）、出血性卒中（HR = 1.01）、TIA（HR = 1.06）及预设SCT × CKD交互分析（交互HR = 1.13；p = 0.51）结果亦一致。相反，HbSS与缺血性卒中风险显著升高相关（HR = 5.12，95% CI 2.96–8.85；p < 0.001）。从粗率比到祖先调整后HR的衰减与HbAS较HbAA参与者非洲遗传祖先比例更高（88.1% vs 20.8%）所致实质性混杂一致。讨论：在一项大型WGS确认、祖先调整的队列研究中，SCT与缺血性卒中发病风险无显著关联。调整遗传祖先後粗关联的显著衰减提示既往报告的关联至少部分可能反映祖先相关混杂和群体结构而非SCT的强独立效应。这些发现不支持SCT与该队列中缺血性卒中发病存在临床有意义的独立关联。
研究背景：镰状细胞特质（SCT）是血红蛋白β亚基（HBB）基因错义变异rs334所致的杂合携带状态（HbAS），全球约3亿人受累，美国非裔人群中占8–10%。与镰状细胞病（SCD，最常见为纯合HbSS）不同，SCT历来被视为临床良性携带状态。SCD的卒中风险已明确，但杂合SCT是否独立增加缺血性卒中风险尚不明确。既往研究结果不一，部分报告风险增加，部分未发现显著关联。这种不一致可能反映特定情境下真实的小效应，也可能反映SCT确认方法异质、残余血管混杂、群体分层及选择性报告。澄清这一区别具有重要意义，因为SCT常见，阳性关联即使为假象也可能影响咨询和风险归因。既往研究存在重要方法学局限：许多研究样本量较小、祖先多样性有限或SCT确认方法不一；此外，很少有研究利用全基因组数据校正遗传祖先，使观察到的关联究竟反映SCT本身还是潜在群体结构仍不确定。因此，核心未解问题并非SCT是否导致与SCD相同的卒中生物学，而是既往报告的流行病学关联代表SCT独立效应还是研究设计、群体结构和残余混杂的假象。NIH All of Us（AoU）研究项目通过WGS确认的HBB基因分型、源自全基因组数据的预计算遗传祖先主成分及可确认脑血管事件发病的纵向电子健康记录（EHR）随访，为解答此问题提供了独特机会。研究人员在275,530名AoU参与者（贡献337万人年随访）中评估SCT与缺血性卒中发病的关联，并预设调整遗传祖先。研究人员假设SCT与缺血性卒中之间的任何粗关联在调整遗传祖先和血管危险因素后将显著衰减，符合混杂而非SCT强独立效应的解释。
关键技术方法：研究采用NIH AoU受控层级数据集CDR v8（C2024Q3R9），基于AoU短读WGS流程（目标深度≥30×）提取rs334和rs33930165位点基因型，基因型质量过滤要求基因型质量（GQ）≥30、读取深度（DP）≥20、杂合调用等位基因平衡0.35–0.65。队列纳入18–75岁、有EHR数据且至少12个月纵向随访的WGS参与者，排除入组前有缺血性卒中、出血性卒中或TIA记录者。主要结局为入组后住院 encounter 首次记录的ICD-10 I63.x系列缺血性卒中。协变量包括年龄、性别、高血压、糖尿病、心房颤动、CKD、BMI、吸烟及遗传祖先主成分1–10（源自AoU预计算WGS祖先流程ancestry_preds.tsv）。统计采用多变量Cox比例风险模型（岭惩罚λ=0.01），并以竞争风险模型、logistic回归、5项敏感性分析及12项预设亚组分析作为次要分析。样本队列来源为AoU CDR v8中414,830名有WGS数据的参与者。
研究结果：（1）研究人群与HBB基因型分布：在633,547名AoU CDR v8参与者中，414,830名有WGS数据；应用合格标准后275,621名构成分析基础队列，排除91名有既往脑血管事件者后，缺血性卒中发病队列为275,530名，包括269,404名HbAA、5,876名HbAS、144名HbSS和106名HbAC。HbAS参与者非洲遗传祖先比例显著高于HbAA（88.1% vs 20.8%），HbSS中96.5%为非洲遗传祖先；HbAS参与者高血压（40.7% vs 34.9%）、糖尿病（23.3% vs 17.5%）和CKD（10.9% vs 7.1%）患病率均高于HbAA。（2）发生率与粗比较：在3,374,790人年随访中共观察到2,323例缺血性卒中发病。HbAA粗发生率为0.67/1000人年（95% CI 0.65–0.70），HbAS为1.15/1000人年（95% CI 0.92–1.42），HbSS为7.09/1000人年（95% CI 3.88–11.90）；HbAS vs HbAA粗发生率比为1.70。（3）主要分析——缺血性卒中发病：在多变量Cox模型中调整年龄、性别、高血压、糖尿病、心房颤动、CKD、BMI、吸烟及遗传祖先主成分1–10后，HbAS与缺血性卒中发病无显著关联（HR = 1.06，95% CI 0.89–1.25；p = 0.53）。嵌套模型中，调整年龄、性别和遗传祖先主成分后HbAS的HR为1.10（95% CI 0.92–1.30），进一步调整心血管危险因素后为1.07（95% CI 0.90–1.27），完全调整模型为1.06（95% CI 0.89–1.25）。HbSS与缺血性卒中发病相关（HR = 5.12，95% CI 2.96–8.85；p < 0.001）。Kaplan-Meier累积发病率曲线显示HbSS曲线与HbAA和HbAS曲线显著分离，而HbAA与HbAS基本重叠。（4）竞争风险分析与患病分析：病因特异性竞争风险分析中，HbAS相关缺血性卒中发病HR为1.06（p = 0.53），死亡病因特异性HR为1.00（p = 0.96）。全队列（n = 275,621）患病脑血管病logistic回归中，HbAS比值比为0.97（95% CI 0.78–1.20；p = 0.75）。（5）次要结局与阳性对照结局：HbAS与出血性卒中（HR = 1.01，95% CI 0.81–1.27；p = 0.91）、TIA（HR = 1.06，95% CI 0.84–1.33；p = 0.62）或心房颤动发病（HR = 0.94，95% CI 0.81–1.10；p = 0.47）均无关联。HbSS参与者心房颤动发病HR为1.74（95% CI 0.97–3.11；p = 0.06），HbSS亦与肾脏并发症发病相关（HR = 1.60，95% CI 1.22–2.10；p = 0.0006）。（6）亚组分析：HbAS在12项预设亚组中均与缺血性卒中发病无关联，HR范围为0.94–1.15，所有CI均包含1.0；年龄组（<50、50–64、65+岁分层HR范围0.96–1.15）、两性、有无高血压（高血压参与者HR = 1.00）及非洲祖先分层（HR = 0.97，95% CI 0.81–1.16；n = 5,176名HbAS，76例事件）结果相似，与限定于非洲遗传祖先参与者的单独敏感性分析（HR = 0.98，95% CI 0.82–1.17）一致。（7）敏感性分析与交互检验：比例风险假设得到近似平行log-log生存曲线及序贯时间分割中HbAS HR稳定的支持。所有预设及额外敏感性分析结果与主要分析一致：严格缺血性卒中定义（≥2次住院编码）HR = 1.00（95% CI 0.83–1.21；p = 0.99）；排除基线CKD者HR = 1.08（95% CI 0.88–1.32；p = 0.45）；排除基线心房颤动者HR = 1.04（95% CI 0.88–1.24；p = 0.64）；限定非洲遗传祖先者HR = 0.98（95% CI 0.82–1.17；p = 0.82）；严格基线协变量定义HR = 1.09（95% CI 0.92–1.29；p = 0.34）；BMI多重插补（HR 1.06，95% CI 0.89–1.25；p = 0.53）和完整病例分析（HR 1.05，95% CI 0.89–1.25；p = 0.55）结果不变。时间依赖协变量分析中，5,089例心房颤动发病和28,882例CKD发病作为时间更新协变量建模，二者均与更高缺血性卒中风险相关（心房颤动HR 2.50，95% CI 2.27–2.75；CKD HR 3.35，95% CI 3.10–3.62；均p < 0.001），HbAS关联仍为无效且基本不变（HR 1.06，95% CI 0.89–1.24；p = 0.53）。预设SCT × CKD交互检验交互HR为1.13（95% CI 0.79–1.60；p = 0.51）。
讨论部分总结：研究人员的研究提示，与SCD不同，SCT在调整遗传祖先和血管危险因素后与缺血性卒中发病无显著关联。研究结果提示SCT卒中文献的不一致可能主要反映流行病学因素包括群体分层和残余混杂，而非与SCD相当的重大生物学不确定性。调整前观察到的粗关联在考虑祖先後显著衰减，与既往阳性关联受群体结构而非SCT直接效应影响一致。由于为观察性队列研究，这些发现不应被解读为无因果效应的确定性证据；结果反对SCT对缺血性卒中发病存在大型或临床有意义的独立效应，但不能完全排除小的残余或情境特异性效应。本数据中粗卒中发生率比1.70与既往阳性研究报告的升高效应估计幅度相似。既往研究多受样本量较小、祖先代表性较窄和SCT确认方法不一致限制，但最重要局限是遗传祖先调整不完整。调整遗传祖先主成分1–10后HR衰减至1.06，与队列内群体结构的实质贡献一致：HbAS参与者88.1%被分类为非洲遗传祖先，而HbAA为20.8%。在美国，卒中负担在不同人群间的差异主要源于高血压、糖尿病、CKD、医疗服务可及性及更广泛结构性不平等的分布不均；若不调整遗传祖先，这种背景卒中风险差异可能被错误归因于HbS变异，产生既往文献中的升高效应估计。同时，由于HbAS与祖先高度相关，使用全队列主成分调整理论上可能衰减基因型相关信号；为此研究人员进行了非洲遗传祖先限制敏感性分析，关联仍为无效，该一致性反对主要结果仅由多祖先队列稀释解释，但不能完全排除全局主成分调整相关的残余问题。分析的若干特征旨在加强因果解释，包括WGS确认暴露分类、全基因组祖先主成分调整、限定非洲遗传祖先参与者、出血性卒中作为阴性对照结局及HbSS参与者肾脏并发症作为阳性对照结局；然而残余混杂、AoU选择偏倚、结局错分和未测量因素仍可能存在，因此发现最好解释为反对临床有意义的独立关联的证据而非确定性因果排除。既往许多研究使用直接血红蛋白检测或临床SCT诊断而非WGS，其主要方法学局限不仅在于暴露确认，更在于缺乏全基因组遗传祖先调整；正确识别SCT携带者但未调整遗传祖先的研究在 predominantly 非裔美国人队列中仍可能产生偏倚估计，在此背景下纳入全基因组祖先主成分是本研究的核心方法学优势。HbAS无效估计与HbSS显著升高估计的对比为总体发现提供了内部生物学支持：HbAS与缺血性卒中发病无关联，而HbSS与显著更高风险相关。SCD通过慢性溶血性贫血、血管闭塞、内皮激活和异常脑血流动力学等明确机制导致卒中，这些机制在杂合状态通常生理条件下基本缺失或显著减弱。需注意HbSS仅有144名参与者和14例事件，其信号虽统计学稳健，应谨慎解释为支持性背景而非正式验证分析。所有亚组分析结果一致性提示不存在SCT赋予显著更高缺血性卒中风险的明确可识别亚组；特别未发现CKD或高血压改变SCT与卒中关系的证据，CKD参与者总体卒中风险更高似反映CKD相关背景血管风险而非独特SCT相关效应，因此这些发现不支持CKD或高血压作为SCT-卒中关联的主要修饰因素。研究结果不支持将SCT视为需要超出标准一级预防策略特定预防干预的独立卒中危险因素；临床医生评估SCT携带者卒中风险应关注可改变危险因素包括高血压、糖尿病和心房颤动，而非将升高风险归因于SCT基因型本身；同时本队列中SCT人群显著更高的心血管危险因素负担凸显了该人群公平心血管危险因素管理的紧迫性，反映 disproportionately 影响黑人/非裔美国人的更广泛结构性不平等而非SCT本身直接效应。研究局限性包括：AoU队列可能不完全代表美国人群；HbAS集中于非洲遗传祖先参与者，使用全多祖先队列全局祖先主成分理论上可能衰减祖先相关基因型信号，虽非洲祖先限制敏感性分析亦为无效，但受AoU分析环境计算资源限制无法在非洲祖先亚组内重新计算祖先特异性主成分；卒中确认依赖EHR的ICD-10编码而非影像确认诊断，虽住院 encounter 要求旨在提高特异性；HbS和HbC基因型经WGS确认，但未系统识别β-地中海贫血变异或相位HbS/β-地中海贫血复合杂合子，罕见HbS/β-地中海贫血参与者可能被纳入HbAS组，由于HbS/β-地中海贫血预期临床风险高于无并发症SCT，此潜在错分可能使HbAS估计偏高而非解释观察到的无效关联；主要分析协变量务实地确认至病例事件日期或非病例最后EHR日期而非限定于队列入组，此选择旨在减少纵向EHR数据中合并症确认不足，但若部分疾病在入组后发生可能引入基线后协变量调整或过度调整，不过预设基线-only协变量定义敏感性分析结果相似，减轻了对此建模决策实质性改变研究主要结论的担忧；虽心房颤动和CKD在敏感性分析中作为时间更新协变量评估，高血压和糖尿病因EHR缺乏可靠发病日期而保留为基线协变量；口服避孕药使用作为年轻女性SCT卒中风险潜在修饰因素在AoU EHR中未可靠捕获，无法评估，限制了对育龄女性的评估；卒中亚型分类限于ICD-10编码，无法获取影像或临床记录对卒中亚型进行裁定。
研究结论翻译：研究人员的研究提示，在调整遗传祖先和血管危险因素后，SCT与缺血性卒中发病无显著关联。祖先调整后粗关联的衰减进一步支持既往报告的阳性关联可能反映混杂而非SCT直接效应的解释。虽不能排除小的残余效应，这些发现不支持SCT作为独立缺血性卒中危险因素。进一步的因果推断研究，特别是在遗传定义祖先组内及采用裁定卒中结局的研究，可能有助于澄清是否存在任何小的情境特异性效应。
