《Animal Genetics》：Genome-Wide Analysis of Resistance to Gastrointestinal Parasites in Portuguese Merino and Merino-Related Sheep
编辑推荐：
胃肠道线虫（GIN）是全球放牧型畜牧生产体系面临的主要制约因素之一，严重影响绵羊养殖业。几十年来，基于驱虫药的控制策略被广泛使用，最终导致了多重耐药蠕虫株系的出现。针对疾病抗性的选择性育种是一种长期可持续的策略，可改善动物健康、福利和生产性能。因此，研究人员利
胃肠道线虫（GIN）是全球放牧型畜牧生产体系面临的主要制约因素之一，严重影响绵羊养殖业。几十年来，基于驱虫药的控制策略被广泛使用，最终导致了多重耐药蠕虫株系的出现。针对疾病抗性的选择性育种是一种长期可持续的策略，可改善动物健康、福利和生产性能。因此，研究人员利用定制化SNP芯片进行了一项全基因组关联研究（GWAS），旨在鉴定与葡萄牙美利奴及相关绵羊群体中GIN抗性/易感性相关的基因组区域和分子机制。位于着丝粒蛋白K（CENPK）（chr 16; 14?439?999?bp）和NADH:泛醌氧化还原酶复合体组装因子2（NDUFAF2）（chr 16; 19?366?442?bp）基因区域内的两个SNP达到了全基因组Bonferroni显著性水平（p = 2.08 × 10?6）。此外，还检测到五个全基因组暗示性SNP，分别位于腺瘤性息肉病大肠杆菌WNT信号通路调节因子（APC）（chr 7; 1?050?994?bp）、G蛋白信号调节因子8（RGS8）（chr 12; 68?278?650?bp）和低氧诱导因子3亚基α（HIF3A）（chr 14; 57?059?428?bp）的基因区域内，以及靠近钙结合卷曲螺旋结构域1（CALCOCO1）和ATP合酶膜亚基C位点2（ATP5MC2）（chr 3; 142?391?546?bp）以及信号素-6D（SEMA6D）（chr 7; 65?321?727?bp）的基因间区域。这些区域中的候选基因参与肠道稳态维持、上皮屏障增强以及免疫应答调控机制。这些结果为理解葡萄牙美利奴羊GIN感染的遗传结构提供了新的有用信息。需要进一步的分析来验证这些SNP，并评估其对旨在选育具有更强GIN抗性动物的选择策略的贡献。
研究背景与科学问题
胃肠道线虫（GIN）是全球放牧型畜牧业面临的主要健康威胁，尤其在小反刍动物产业中造成严重经济损失。在葡萄牙，本土绵羊群中已报告多种GIN物种，包括Teladorsagia、Cooperia、Trichostrongylus、Haemonchus、Oesophagostomum和Chabertia等属。GIN感染会导致消化道损伤和炎症，引发生长速率下降、胴体重减轻、产奶量降低、贫血和腹泻等严重后果。长期以来，控制策略依赖驱虫药物，但由于高昂的成本和全球范围内抗药性蠕虫株系的不断涌现，这种方法的长期可持续性受到质疑。近期一项研究描述了葡萄牙多个小型反刍动物农场驱虫药耐药性增加的情况，凸显了寻求有效且可持续控制策略的紧迫性。因此，培育对寄生虫具有抗性、减少对驱虫药依赖的绵羊品种，应能提升绵羊养殖体系的健康度、可持续性和盈利能力。了解寄生虫抗性背后的遗传结构，通过准确定位基因组标记物，可以与其他综合疾病控制方法相结合，成为改善动物健康和生产力的有力工具。
研究方法概述
研究人员从位于葡萄牙南部阿连特茹地区的17个农场采集了共1436只动物样本，包括Merino Branco（N=356）、Merino Preto（N=142）及其杂交后代（N=938）。粪便虫卵计数（FEC）采用改良McMaster法测定，并据此将感染状态分为六个类别。血液样本用于测定红细胞压积（PCV）和总血清蛋白（TP）等血液学参数。基因组DNA提取后，使用定制化SNP芯片进行基因分型，并通过PLINK软件进行质量控制，最终保留29626个SNP和1373只动物用于下游分析。缺失基因型数据由Beagle v.5.4进行填充。全基因组关联分析（GWAS）采用statgenGWAS包中的混合线性模型进行，模型中包含品种、牧场、采样月份、年龄和性别作为固定效应，并以亲缘关系矩阵作为随机效应来控制群体分层。调整后的Bonferroni全基因组显著性阈值为p = 2.08 × 10?6，暗示性阈值为p = 4.16 × 10?5。基因注释和功能分析通过Ensembl数据库和DAVID在线服务器完成。
研究结果
3.1 表型统计
FEC范围从0到20000 EPG（平均值为271.3 ± 776.4 EPG），大多数动物表现为低寄生虫负荷。寄生虫抗性表型的遗传力估计值为0.128 ± 0.145。在GIN各属的平均比例丰度中，Trichostrongylus sp.最为丰富（54.8%），其次是Teladorsagia sp.（26.2%）、Chabertia sp.（8.1%）、Oesophagostomum sp.（6.8%）和Haemonchus sp.（4.2%）。
3.2 全基因组关联分析
经过质量控制和关联分析，研究人员在OAR16染色体上检测到两个达到全基因组Bonferroni显著水平的SNP（位于14?439?999?bp和19?366?442?bp），以及在OAR3（142?391?546?bp）、OAR7（1?050?994?bp和65?321?727?bp）、OAR12（68?278?650?bp）和OAR14（57?059?428?bp）上检测到五个全基因组暗示性SNP。对于两个全基因组显著SNP，携带两个拷贝替代等位基因的动物其平均FEC类别更高。QQ图显示基因组膨胀因子λ等于0.99，表明群体分层导致的潜在偏差已得到控制。
3.3 基因注释与功能分析
结构注释揭示了显著关联SNP在已知基因区域内的物理位置。全基因组显著SNP位于CENPK（着丝粒蛋白K）的外显子区和NDUFAF2（NADH:泛醌氧化还原酶复合体组装因子2）的内含子区。暗示性SNP则位于RGS8（G蛋白信号调节因子8）的3‘UTR区、APC（腺瘤性息肉病大肠杆菌WNT信号通路调节因子）和HIF3A（低氧诱导因子3亚基α）的外显子区，以及靠近SEMA6D（信号素-6D）、CALCOCO1（钙结合卷曲螺旋结构域1）和ATP5MC2（ATP合酶膜亚基C位点2）的基因间区域。功能富集分析识别出两个与免疫反应中炎症和调控过程相关的GO条目：Wnt信号通路（GO:0016055）和β-连环蛋白结合（GO:0008013）。
讨论与结论
讨论总结： 小反刍动物生产体系易受寄生虫病影响，而宿主-寄生虫相互作用受宿主遗传构成、营养、年龄和生理状态的复杂影响。气候变化加剧了这一问题，因为它会影响GIN的整体丰度、季节性和空间分布。GWAS研究表明，宿主对GIN的抗性是由多种遗传因素决定的复杂性状，可分为三类主要机制：先天免疫应答、获得性免疫应答和止血作用。研究人员将GWAS结果组织成三个主要功能轴来解释宿主-寄生虫互作：（1）肠道稳态与上皮屏障功能：APC基因编码的蛋白对维持肠道稳态至关重要，它作为WNT信号通路的负调控因子，参与细胞迁移、粘附和凋亡等过程。HIF3A基因属于HIF家族，调控细胞对低氧水平的适应，通过调节紧密连接蛋白的表达来增强上皮屏障完整性。（2）免疫应答激活与调控中的信号与调控机制：RGS8基因通过加速G蛋白失活来调节GPCR（G蛋白偶联受体）下游的信号通路，这对维持平衡的免疫应答至关重要。NDUFAF2和ATP5MC2基因与ATP合成相关，可能通过维持细胞功能和能量平衡来支持免疫细胞活动和肠神经元调控。（3）胃肠道寄生虫与肠道功能的神经调控：SEMA6D基因编码的信号素家族蛋白被认为是神经系统和免疫系统之间串扰的关键分子，可能通过调控T细胞活化和肠道驻留巨噬细胞极化来调节抗寄生虫免疫应答。
研究结论： 本研究是首次探究葡萄牙美利奴及相关绵羊对GIN免疫应答遗传基础的基因组学方法。研究人员在OAR16上鉴定出两个全基因组显著关联SNP，并在OAR3、OAR7、OAR12和OAR14上检测到五个暗示性SNP。候选基因被描述与肠道稳态调节、上皮屏障功能以及与免疫应答相关的信号通路有关，这些机制直接参与GIN诱导疾病的发病机制。两个与WNT信号通路和β-连环蛋白结合相关的GO条目显著富集。这些结果是识别参与胃肠道寄生虫抗性/易感性基因组区域的重要第一步，有助于更好地理解葡萄牙美利奴羊这一性状遗传结构的复杂性。所有候选基因均可被视为开发未来控制GIN感染基因组工具的宝贵资源。然而，需要进一步验证以确认其在选择性育种中的实用性。总之，本研究为进一步证明涉及多种生物学机制的复杂胃肠道寄生虫免疫应答提供了证据，研究结果有助于增进对GIN遗传抗性/易感性的认识，并有望通过育种计划改善葡萄牙美利奴羊的健康和生产性能。
