《Biotechnology and Bioengineering》：A Microfluidic TFF Device for Biopharmaceutical Process Development: Scale-Down Verification of Ultrafiltration and Diafiltration Modes for Monoclonal Antibodies
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切向流过滤（TFF）是下游生物加工中的关键操作，但传统缩小模型需要大量物料且往往无法再现与规模相关的流体力学条件。研究人员开发了一种微流控TFF（μTFF）平台，该平台可保持壁面剪切率（?wall）和跨膜压（TMP），从而支持以低体积开展超滤/透析过滤（UF/
切向流过滤（TFF）是下游生物加工中的关键操作，但传统缩小模型需要大量物料且往往无法再现与规模相关的流体力学条件。研究人员开发了一种微流控TFF（μTFF）平台，该平台可保持壁面剪切率（?wall）和跨膜压（TMP），从而支持以低体积开展超滤/透析过滤（UF/DF）工艺研究。通过迭代设计流道几何结构和膜选择，最终装置实现了稳定运行、高回收率，并将进料体积低至10 mL（UF）和1 mL（DF）的运行时间缩短至2.33 h。在匹配剪切率条件下运行时，μTFF平台再现了关键台架规模过滤特征，包括过滤时间、TMP行为、渗透通量（Jp）曲线以及高于88%的收率且渗透损失可忽略。该装置还分辨了聚醚砜（PES）和再生纤维素（RC）化学膜材料间的膜依赖性行为，显示PES膜具有一致的跨尺度趋势，同时揭示了膜特异性变异对RC膜性能和跨尺度可比性的影响。该μTFF系统经牛血清白蛋白（BSA）验证并随后用单克隆抗体（mAb）验证，展示了可重复的缓冲液置换、维持了蛋白质完整性并再现了关键传输现象。其低工作体积、快速周转以及维持规模相关流体力学的能力，使μTFF平台成为TFF工艺优化的高通量筛选工具，支持更快的开发周期和纯化策略评估。
**研究背景与问题**
切向流过滤（TFF）是现代下游生物制造的核心单元操作，其错流配置通过将截留物从膜表面扫除以有效减少膜污染，从而在长时间内维持高渗透通量（J），在通量方面显著优于死端过滤。TFF可运行于多种模式，如超滤或浓缩（UF）和透析过滤或缓冲液置换（DF），也适用于连续在线操作。TFF放大关注保持关键流体力学和操作参数，包括膜负载量、进料错流（QF）归一化后的进料通量（JF）、稳态渗透通量（Jp）、跨膜压（TMP）、进料与截留流之间的压降（?P）以及壁面剪切率（?wall）。准确的TFF放大需要跨尺度保持膜负载量、?wall、TMP、通量和?P，此外膜阻力（Rm）必须保持一致，需选择具有等效性质的膜。截留物体积及其与系统持留体积的比较也需考虑，以防止涡流形成和气液界面不稳定导致的非代表性流体力学。设备设计元素可影响额外放大参数，例如流道尺寸可影响?wall。因此，虽然TFF单元操作工艺性能通常可放大，但可能需要大量实验研究来开发工艺并将其放大至生产规模。尽管这适合高通量工艺开发（HTPD）和高通量筛选（HTS）技术和工作流程，但TFF在现有HTPD工具包中仍代表性不足，主要原因是难以在微尺度模拟其连续流行为。这构成了生物制药工艺开发中的重大挑战和机遇。
近年来TFF技术的进展促成了低体积自动化UF/DF筛选平台的开发，包括Ambr Crossflow系统和Formulatrix TFF系统。Ambr Crossflow可实现自动化平行UF/DF筛选，循环体积低至5 mL，使用专用10 cm2膜组件；Formulatrix μPulse和aμtoPulse系统分别支持起始体积低至1 mL和0.5 mL的UF/DF操作，报道的持留体积分别为0.65 mL和0.25 mL。然而这些平台主要依赖专有膜格式、过滤芯片和供应商特定耗材。替代的高通量平台如微孔过滤板无法再现TFF的错流流体力学。相比之下，连续流操作的微流控系统为小型化高通量TFF筛选平台提供了有前景的路径。超缩小（USD）装置和微流控模块的最新进展已展示潜力，但大多数缺乏快速更换膜所需的模块化性或在不同过滤模式下运行的灵活性。此外，这些系统在实现高渗透通量和达到最终截留物浓度≥100 g·L?1所需的浓缩因子方面仍有不足。因此，仍需要灵活的微流控平台，结合低操作体积、快速膜互换性、多制造商和多化学膜评估以及受控规模关键工艺条件下的连续流操作。
**研究内容与结论**
本研究对μTFF装置进行了全面评估，评估其在全循环、UF和DF模式下的性能，以及在不同膜化学材料间的兼容性和向台架规模的可放大性。μTFF装置膜面积为1.42 cm2，内部体积为0.02 cm3，使用隔膜泵操作时系统持留体积约为0.410 ± 0.02 cm3。该装置作为微流控缩小平台开发，能够连续UF和DF操作同时保持规模关键工艺参数的控制。使用隔膜泵配置，以低至1 mL的起始进料体积展示了连续UF/DF操作。实验条件被转化至台架规模平板盒（50 cm2）和中空纤维模块（13 cm2），并比较了跨尺度工艺性能。确定的最佳泵送配置和流道几何结构被纳入最终装置设计，并使用模型蛋白和mAb进料流进行评估。产品回收率、缓冲液置换效率和工艺时长在广泛的操作条件、膜化学材料和过滤模式下进行了评估。与现有依赖专有膜耗材的商业小规模TFF平台以及先前报道的USD和微流控系统不同，μTFF装置结合了多模式过滤、来自不同制造商和化学材料的商业可用膜的快速更换以及在低进料和持留体积下维持规模关键参数控制的操作。这些特征使该平台成为高通量膜工艺开发的通用且物料高效的工具。
**关键技术方法**
研究人员采用微流控TFF装置（μTFF），以聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）板构建夹紧组件围绕过滤膜和密封元件，通过CNC加工制造，经D0至D15多轮迭代优化流道几何结构（最终配置为0.1 mm截留流道高度和5 mm渗透流道高度）。实验系统配置在线压力传感器和流量传感器，可使用注射泵、蠕动泵或微隔膜泵驱动。膜为30 kDa的PES或RC材质，来自不同制造商（以MA-MC盲化标识）。台架规模验证使用13 cm2 PES中空纤维模块和50 cm2平板盒。评估了牛血清白蛋白（BSA）和两种单克隆抗体（mAb1为内部生产，mAb2为商业采购）的UF和DF性能。采用BCA法和BGG标准品定量蛋白浓度，动态光散射（DLS）评估mAb聚集状态。统计分析使用Python进行，包括单因素方差分析、Tukey HSD事后检验、Kruskal-Wallis检验和Mann-Whitney U检验。
**研究结果**
**μTFF平台的优化**：先前报道的μTFF平台在UF模式下评估显示，尽管蠕动泵和隔膜泵连续循环相比注射泵操作改善了质量回收率，但过滤运行时间仍远长于传统台架规模TFF系统。流变学分析表明粘度不是运行时间延长的主要原因。隔膜泵配置提供最稳定的TMP控制和一致的产品回收率，被选用于后续优化研究。使用商业台架规模PES盒系统在匹配TMP和进料通量条件下进行比较，台架规模系统完成10倍浓缩过程显著快于微流控平台，表明运行时间延长主要源于装置设计限制而非过滤过程本身。原装置1 mm宽流道促进了沿进料流路的压力损失，降低了有效TMP利用和过滤效率。重新设计的D0配置采用更宽的截留和渗透流道及改进的密封策略，将过滤运行时间从约15 h缩短至5.38–6.33 h。后续优化研究了流体连接几何结构和振动辅助操作以及截留和渗透流道高度的影响。最终装置配置（D15）采用0.1 mm截留流道高度和5 mm渗透流道高度，实现了2.33 h的过滤运行时间同时维持产品回收率。
**优化μTFF的缩小验证**：最终μTFF配置（D15）的可放大性通过与台架规模TFF系统在匹配?wall和TMP条件下的比较进行评估。由于大多数商业TFF盒的流道几何结构为专有，选择PES中空纤维系统进行基于?wall的缩小研究。在三个 defined ?wall值下进行过滤实验，比较产品回收率、过滤运行时间和渗透通量。统计分析显示跨尺度在任何?wall或VCF下收率无显著差异（p > 0.05），证明有效的放大。蛋白质透过率保持可忽略（< 0.32%）。过滤运行时间随?wall增加而降低，与膜过滤理论和先前研究一致。在等效?wall条件下运行时间在微尺度和台架规模系统之间密切匹配，确认基于剪切率的放大准确保持了工艺性能。最大偏差出现在1667 s?1，微尺度装置仅需多20.4 min（17.26%），该变异水平在TFF操作的预期实验范围内。微尺度渗透通量曲线显示初始高通量快速下降后稳定，产生随时间更一致的通量。较高?wall导致更大的初始渗透通量和更高的平均渗透通量值。
**膜原材料对跨尺度TFF性能的影响**：在建立μTFF装置可放大性后，评估了其跨膜材料和制造商的适用性，比较收率回收率、过滤时间和渗透通量与相应台架规模盒。PES和RC膜来自制造商MA和MC在微尺度测试，实现尺度内材料比较，也进行了向台架规模的放大比较。PES膜跨尺度和制造商的比较显示高度一致的收率回收率，无显著差异（p > 0.05），除1.3 VCF处MC PES膜在μTFF系统中显示较低截留回收率。渗透损失在所有系统中保持低水平（< 2.26%）。清洗步骤中MC膜回收蛋白显著多于MA膜（p = 1 × 10?3），该趋势在微尺度放大（p = 4 × 10??）。这些差异与观察到的过滤时间密切相关。MA膜实现显著更短的运行时间，微尺度2.18 h和台架规模2.11 h，而MC膜分别为3.29和3.75 h。μTFF数据提供进一步机制洞察：MA膜维持更高更稳定的渗透通量曲线，解释其缩短的处理时间。RC膜显示更大的跨尺度变异性，这些趋势与RC膜对制造变异的敏感性一致，影响孔结构、亲水性和抗污染性。从4 VCF起，MC微尺度膜显著劣于MC SU和MC R盒。MC微尺度膜在高VCF下性能较差可能源于增加的浓差极化、表面污染或通过渗透的蛋白损失。渗透分析确认MC微尺度膜在10 VCF时显著蛋白损失（28.38%），相比台架规模实验< 1.5%，解释其较短过滤时间但降低的选择性和整体回收率。初始水通量测量进一步支持这一点，显示MC微尺度膜具有更高的NWP（6.79 × 10?1? m·Pa?1·s?1）相比MC盒（3.64–4.12 × 10?1? m·Pa?1·s?1）。这些发现强调制造变异对过滤的强烈影响，即使相同材料的膜也可能因生产方法和添加剂而形态和表面化学不同，强调标准化对一致跨尺度性能比较的必要性。
**微流控TFF平台在透析过滤应用中的尺度转化**：在通过UF实验跨尺度验证μTFF装置配置D15后，评估其作为工艺开发潜在筛选工具的DF适用性。使用μTFF装置进行100 g·L?1 BSA的DF，并与中空纤维模块跨尺度比较。DF操作使用Tris-HCl在连续恒体积透析过滤模式下运行直至达到五个Nd，期间评估产品收率回收率作为透析过滤次数的函数。五个Nd和两个尺度间在截留和清洗步骤中的收率差异无统计学意义（p > 0.05），表明产品回收率保持高且一致（93%）跨尺度和整个透析过滤过程，仅小部分在清洗步骤回收（约4.5%），渗透中未检测到蛋白。五个Nd的运行时间在微尺度和台架规模系统之间也密切匹配（4.14 vs. 4.39 h），但长于相应UF实验。该较慢速率可能由于渗透通量在整个DF操作期间保持低于20 LMH且相对稳定，没有UF特征的明显初始峰值，反映DF中较高的初始进料浓度（100 g·L?1 BSA）相比UF（10 g·L?1 BSA）。在线pH和电导率监测确认两个尺度有效的缓冲液置换，密切达到目标DF缓冲液性质。两个尺度显示pH和电导率初始陡升，逐渐平台接近目标值并达到稳态，如DF操作中典型。
**mAb1和mAb2 UF/DF在微流控TFF平台上的性能评估**：研究了两种mAb在UF/DF操作中的表现，包括mAb1和mAb2。两种mAb在微尺度和台架规模评估UF模式。DF模式下，mAb1仅在微尺度评估由于材料可用性限制，mAb2在两个尺度评估。两种mAb跨尺度UF产品回收率在等效VCF下无显著差异（p > 0.05）。然而，VCF 1.33与更高VCF 2和10之间观察到统计学显著差异（p < 0.05）。VCF 1.33较低收率可能归因于浓缩步骤开始时的初始缓冲液稀释或混合不完整。mAb1在VCF 10–12.2和mAb2在VCF 10的最终回收率超过90%，表明初始变异对整体UF回收率影响极小。渗透中检测到的mAb量可忽略（< 0.37%）。缓冲液清洗步骤的回收率也极小且跨尺度一致，范围4%–7%，导致良好的质量平衡闭合。所有Nd的收率保持一致，mAb1范围88%–90.5%，mAb2跨尺度范围73%–78%。mAb1渗透中未检测到蛋白，mAb2显示< 3%渗透损失。DLS分析显示mAb1初始Z-平均直径为12 nm，与单体mAb尺寸一致，而mAb2显示较大初始直径（32 nm）。尽管有此差异，两种mAb在UF/DF过程中维持PDI值≤ 0.25，表明相对窄的尺寸分布。DF后两种mAb显示Z-平均直径增加，mAb1仅适度偏移（26 nm），但mAb2在微尺度（120 nm）和台架规模（134 nm）更显著增加。mAb2观察到的增加跨尺度相似，持续低PDI值表明微流控和台架规模系统未引入显著尺寸分布差异。TMP曲线提供进一步工艺性能洞察。DF期间TMP曲线比UF更不稳定，两个尺度均如此，这是预期的因为DF涉及连续缓冲液添加以匹配渗透去除速率，导致任何流量或进料性质波动立即传递至TMP。mAb2较低回收率与严重膜污染无关，因为没有观察到TMP渐进增加或延长处理时间。mAb1较长处理时间反映在其渗透通量曲线中，显示比mAb2更明显的下降。总体Jp随时间降低，从UF过渡到DF操作时跨尺度更明显降低。DF与较低渗透通量和较长处理时间相关，相比相应UF步骤和BSA实验，可能由于DF期间较高蛋白浓度促进膜表面附近蛋白积累并增加局部渗透压。两种mAb在微尺度（mAb1）和微及台架规模（mAb2）达到DF缓冲液目标电导率，确认有效缓冲液置换。mAb2跨尺度密切达到目标pH，而mAb1 pH略低为7.35，该偏差可能由于传感器变异、DF缓冲液与特定mAb的限制或混合不完整，表明可能需要额外DF体积以完全匹配目标pH。
**讨论与结论**
本研究开发了能够进行UF和DF的μTFF平台，并评估其作为生物工艺开发高通量技术的性能。装置优化显著缩短了UF运行时间同时维持高产品回收率、准确质量平衡和稳定TMP控制。在匹配?wall和TMP条件下运行时，μTFF平台密切再现台架规模中空纤维TFF性能，产生可比的过滤时间、渗透通量曲线和产品回收率。该平台也反映了商业可用盒系统中观察到的膜特异性性能趋势。PES膜显示跨尺度一致行为，而RC膜观察到更大变异性，强调膜标准化对可靠跨尺度比较的重要性。μTFF装置进一步展示了可重复的DF性能，实现受控缓冲液置换同时维持跨尺度蛋白截留和回收率。应用于两种mAb确认了对工业相关生物制剂的适用性，并表明代表性UF/DF研究可使用低至10 mL（UF）和1 mL（DF）的进料体积进行。这些结果确立了μTFF平台作为可放大、可预测且物料高效的高通量技术用于TFF工艺开发，支持膜筛选、操作条件优化和尺度转化，同时大幅减少物料需求。
