连续双柱CaptureSMB直接从灌注收获液捕获重组腺相关病毒颗粒

《Biotechnology and Bioengineering》：Continuous Capture of Recombinant Adeno-Associated Virus Particles Using Twin-Column CaptureSMB

重组腺相关病毒（rAAV）因其安全且精准的基因递送能力，在基因治疗中的重要性日益提升。然而，某些适应症需要显著更高的载体剂量，使生产能力和产品成本（COG）逼近极限。本研究对连续双柱捕获工艺（CaptureSMB）进行了概念验证评估，该工艺可直接从经过最少处理、未裂解的灌注收获液中纯化rAAV5，无需预先进行酶法核酸酶消化、浓缩或缓冲液置换。该方法与传统批次工作流程存在根本差异，后者通常要求在亲和捕获前进行澄清和浓缩，本研究为病毒载体制备提供了一种新的工艺整合方式。研究人员首先开发了单柱批次捕获工艺，随后将其与连续CaptureSMB配置进行比较。优化的CaptureSMB操作在四个循环中实现了一致的收率，回收率超过批次操作（+14.3%），同时具有更高的生产率（+11.4%）和更低的缓冲液消耗（?79.2%）。关键质量属性（CQA）分析显示，早期CaptureSMB循环中宿主细胞蛋白水平和残留DNA较低，而rAAV5颗粒的完整衣壳比例、热稳定性和转导效率在各循环和工艺模式间保持不变。然而，后期循环中逐渐升高的背压和残留杂质积累凸显了直接捕获低滴度进料流相关的操作挑战。这些发现表明，直接从分泌型灌注收获液中进行连续双柱CaptureSMB可提高操作效率、降低缓冲液需求，并在某些方面维持乃至改善产品质量。这一新策略为解决rAAV基因治疗生产中的生产能力和成本挑战提供了有前景的途径。

研究背景与问题：重组腺相关病毒（rAAV）因安全性好、递送精准、嗜性广而在基因治疗中受到重视，但系统给药类适应症所需载体剂量极高，给生产能力和产品成本（COG）带来巨大压力。传统大规模rAAV工艺以批次生物反应器瞬时三质粒转染起始，随后经细胞裂解、核酸酶消化、深层过滤和切向流过滤（TFF）浓缩，再进入亲和捕获。裂解、消化、过滤与超滤等步骤可造成上游载体质量20%–80%的损失，并带来滤饼不可逆污染和剪切诱导聚集风险；亲和捕获后还需阴离子交换（AEX）层析提高纯度和完整颗粒比例，整体收率常低至20%–35%。已有连续捕获研究多采用三柱或四柱配置，且进料需预先纯化（含DNA消化和TFF浓缩），所用AAVX亲和树脂在粗料捕获中易因宿主细胞蛋白、核酸和脂质而污染、堵塞，缩短树脂寿命。为此，研究人员提出以分泌型rAAV和灌注培养为基础，跳过裂解、核酸酶消化、深层过滤及捕获前TFF，直接以双柱CaptureSMB从最少处理的灌注收获液中捕获rAAV5，以验证可行性并识别污染动态所决定的操作边界。

研究内容与结论：研究人员先建立单柱批次亲和捕获方法作为参照，再设计并运行双柱连续CaptureSMB，比较两者的收率、生产率和缓冲液消耗，并逐循环分析关键质量属性（CQA）。结果表明，优化后的CaptureSMB在四个循环中收率稳定，回收率较批次提高14.3%，生产率提高11.4%，缓冲液消耗降低79.2%；完整衣壳比例、热稳定性和转导效率在各循环与各工艺模式间保持一致，早期循环的残留DNA和总蛋白低于批次。但后期循环出现背压升高和杂质累积，提示低滴度进料直接捕获的操作挑战。研究意义在于证明该策略可简化rAAV下游流程、提高树脂利用率并降低成本，同时为病毒载体的全整合连续生产奠定技术基础。

关键技术方法：以HEK293F细胞瞬染后于生物反应器灌注培养，经0.4 μm中空纤维模块以反切向流方式连续收获分泌型rAAV5；两次灌注收获液合并、分装冻存并0.2 μm过滤作为均一进料，另保留高滴度收获液用于穿透实验。采用AVIPure AAV5亲和柱在Contichrom CUBE 30系统上先建立批次捕获，再以两台同规格柱运行双柱CaptureSMB（Design A与Design B两套参数）。分析方面用ELISA测定衣壳滴度，AEX-HPLC测定空/完整衣壳比例，BCA法测总蛋白，荧光法测残留dsDNA，GFP转导实验测转导效率，DLS与nanoDSF测多分散指数（PDI）和熔解温度（T_m），并按收率、生产率、缓冲液消耗三项指标评价工艺性能。

研究结果：（1）rAAV生产与穿透曲线：合并后进料滴度为1.8×10¹¹ cp/mL，高滴度料为4.8×10¹¹ cp/mL；在360和214 cm/h流速下获得穿透数据，用于经ChromIQ向导确定批次加载与互连加载时长，Design A采用批次加载1.5%穿透、互连加载17%穿透的动态结合容量（DBC）。（2）工艺设计与污染控制：Design A运行中柱压逐循环升高、收率下降且峰形改变，提示污染累积；Design B将互连加载降至16%、批次加载降至1% DBC，延长清洗（CIP）并将批次加载流速降至270 cm/h，第二次运行采用反向流CIP，虽仍有杂质累积但收率保持稳定。（3）工艺性能：CaptureSMB回收率平均高14.3%，生产率高11.4%，缓冲液消耗低79.2%；仅计循环阶段时预估生产率可提高18%、缓冲液消耗降低82%。（4）质量属性：AEX-HPLC荧光积分所得完整衣壳比例在各洗脱液中恒定于23.2%–24.4%，标准差0.33%；早期循环残留DNA约低一个数量级，第3、4循环升至与批次相当；总蛋白归一化值低于批次但呈上升趋势，停机样品接近批次水平；T_m为88.1–88.5°C；PDI变化与残留DNA类似，第3循环起快速升高，0.2 μm过滤后略降；各洗脱液比活性稳定，与批次相当或略高。

讨论与结论：讨论指出，连续运行提高了树脂利用率，可采用高于批次的加载密度，直接降低昂贵的rAAV亲和树脂成本；仅四个循环即显现优势，延长循环可望获得更大收益，因启动与停机阶段效率最低。逐切换分析表明，污染主要源于残留DNA的非特异性结合，清洗难以完全去除，后期PDI升高可能反映rAAV–DNA复合物等较大颗粒形成，低滴度进料中杂质与产物比例高会加剧该效应。工业层面，批次模式因避免过长加载时间而过度放大层析柱，造成配基利用不足，且多次使用寿命通常少于20次；连续多柱配置可快速高效加载、避免过度放大。研究局限在于使用分别合并的灌注收获液而非全整合工艺，与灌注反应器直接集成是下一步关键。结论译文：本研究评估了CaptureSMB作为传统批次亲和层析的初步概念验证替代方案，用于从最少处理的0.2 μm过滤灌注收获液中直接捕获rAAV5。与批次操作相比，CaptureSMB实现了更高的生产率（+11.4%）、更高的产品回收率（+14.3%）和大幅降低的缓冲液消耗（?79.2%），这些优势源于树脂容量利用率的提高和加载流速的提升及产物损失的减少。包括空/完整比例和转导效率在内的CQA在所有循环中保持一致，残留DNA和蛋白污染在早期循环低于批次值，随后出现逐渐污染。总体而言，双柱CaptureSMB工艺是从最少处理灌注收获液中直接强化分泌型rAAV5亲和捕获的有前景策略，减少了通常导致收率下降的预处理步骤。作为基于分泌和灌注的rAAV生产的可放大替代方案，这一简化方法相对批次操作提高了生产率和回收率并降低了缓冲液消耗。尽管已证明收获液简化的可行性并概念上具备放大潜力，其成功实施取决于进料质量和对循环操作中杂质驱动污染的稳健控制。通过实现从最少处理灌注收获液的高性能、低资源消耗连续捕获，本研究也为病毒载体未来全整合连续生产奠定了技术基础。