野生犬科动物在犬新孢子虫（Neospora caninum）流行病学中的作用：系统综述

《International Journal for Parasitology: Parasites and Wildlife》：The role of wild canids in the epidemiology of Neospora caninum: a systematic review

　　

犬新孢子虫（Neospora caninum）是一种专性胞内寄生的原虫，属于顶复门（Apicomplexa）肉孢子虫科（Sarcocystidae）。该寄生虫可感染多种温血动物，是全球范围内牛流产和犬严重神经系统疾病的重要病因。其生活史为异宿主兼性循环，家犬及其他犬属（Canis）物种作为终末宿主（definitive host, DH），而包括犬科动物在内的多种哺乳动物作为中间宿主（intermediate host, IH）。研究人员按照PRISMA 2020指南开展了系统综述，检索Scopus和PubMed数据库，最终纳入74篇文献。研究目的包括：（1）系统综述支持野生犬科动物在犬新孢子虫循环中双重角色（DH和IH）的证据；（2）批判性评估用于证实DH地位的方法学和诊断标准；（3）评估全球范围内这些物种的暴露、组织感染和传播动态模式。研究结果表明，仅三种犬属物种被确诊为DH，即郊狼（Canis latrans）、澳洲野犬（C. lupus dingo）和灰狼（C. lupus）。大多数研究集中于美洲和欧洲，非洲、亚洲和大洋洲的数据明显不足。方法学异质性限制了研究间的可比性。野生动物犬科动物在犬新孢子虫流行病学中主要作为中间宿主发挥作用。未来研究应优先统一诊断技术和标准，扩展地理覆盖范围，并采用整合性研究设计。

犬新孢子虫（Neospora caninum）是一种专性胞内寄生的原虫，隶属于顶复门（Apicomplexa）肉孢子虫科（Sarcocystidae），可感染多种温血动物，呈世界性分布，是导致牛流产和犬严重神经系统疾病的重要病原。该寄生虫具有异宿主兼性生活史，家犬（Canis lupus familiaris）及其他犬属（Canis）物种作为终末宿主（definitive host, DH），而包括犬科动物在内的多种哺乳动物作为中间宿主（intermediate host, IH）。新孢子虫病最初由Bjerk?s等（1984）在挪威幼犬中描述，表现为中枢神经系统（central nervous system, CNS）病变和肌肉囊肿。随后，McAllister等（1998）确定家犬为DH，Lindsay等（1999）再次证实了粪便可排出卵囊。此后，Basso等（2001）从阿根廷一只自然感染犬中分离出卵囊。其他野生物种也被确认为DH，包括郊狼（C. latrans）（Gondim等，2004a）、澳洲野犬（C. lupus dingo）（King等，2010）和灰狼（C. lupus）（Dubey等，2011）。犬新孢子虫生活史包括三个感染阶段：子孢子（sporozoites，位于DH排出的孢子化卵囊中）、速殖子（tachyzoites，在有核细胞内快速增殖阶段）和缓殖子（bradyzoites，在组织囊肿内缓慢增殖阶段，主要位于CNS和肌肉）。DH主要通过摄入组织囊肿而感染，排出未孢子化卵囊，卵囊在环境中孢子化。在IH中，传播可为水平传播（摄入孢子化卵囊）或垂直传播（经胎盘传播），即速殖子从母体转移至胎儿。卵囊摄入是草食动物唯一确认的出生后传播途径，卵囊在环境中的持续存在使这一阶段对寄生虫流行病学至关重要。尽管野生犬科动物可通过垂直传播维持感染并携带组织阶段，但其作为DH的作用似乎有限；卵囊排出仅在少数个体中有记录，且数量低、持续时间短。在作为IH的犬科动物中，临床表现主要在犬中有描述，先天性感染幼犬表现为神经肌肉症状：瘫痪、虚弱、僵硬和后肢肌肉萎缩。全身性体征如肝肿大、巨食管、淋巴结病和肠病，以及多灶性结节性皮炎也有报道。关于野生动物新孢子虫病的最新综述为Almeria（2013）、Donahoe等（2015）和Dubey等（2017）的研究，这些综述强调了澳洲野犬、郊狼和狼在寄生虫循环中的流行病学意义，并提供了多种犬科动物的血清学数据。然而，自这些发表以来，分子诊断技术取得了重大进展，野外数据不断积累，需要对野生物种的现状进行更新分析。此外，目前缺乏一篇系统概述用于证实野生犬科动物DH地位的方法学的综述，而这是理解卵囊在环境中传播的基础。因此，本研究旨在：（1）系统综述全球范围内支持野生犬科动物在犬新孢子虫循环中双重角色（DH和IH）的证据；（2）批判性评估用于证实DH地位的方法学和诊断标准；（3）评估这些物种的全球暴露模式、组织感染和传播动态。本研究按照PRISMA 2020系统综述声明设计，于2025年11月18日在Scopus数据库中进行系统和结构化检索，检索词为：[(Wild AND cani*) OR lycalopex OR canis AND (Neospora AND caninum)]。为避免遗漏数据，研究人员还检查了最相关已发表论文的参考文献。纳入标准包括：（1）以野生犬科动物犬新孢子虫为焦点的原创研究文章；（2）提供DH角色或感染暴露原始数据的研究；（3）以英文发表的论文。排除标准为：（1）综述文章；（2）仅涉及家犬（C. lupus familiaris）的研究；（3）其他非犬科物种的研究；（4）主要焦点非犬新孢子虫的研究。检索后，元数据导出至Excel数据库。筛选过程包括两阶段评估：首先进行标题和摘要审查以识别可能相关的研究，然后对所选论文进行全文分析。为系统化信息，使用Google Form标准化数据提取，记录关键变量包括：（1）研究目的和设计；（2）目标犬科物种及其地理来源；（3）样本量和基质类型；（4）用于确定DH角色或感染暴露的具体诊断方法；（5）主要发现和结论。此外，在PubMed中使用相同检索词和资格标准进行了额外检索。系统检索初步获得732条记录。经标题和摘要筛选，81篇文章被选入全文资格评估。纳入提供野生犬科动物作为DH或IH原始数据的论文，排除侧重于诊断测试验证或无关主题的论文。PubMed额外检索识别296条记录，经标题和摘要筛选，58条被认为相关；然而，所有符合纳入标准的研究均已通过Scopus识别，无额外文章纳入综述。最终入选74篇文章。值得注意的是，例外纳入了一篇以德文发表的高度相关原创文章。纳入的研究分为两个主要主题方向：（1）评估野生犬科动物作为DH作用的研究；（2）评估寄生虫暴露和感染以确定其IH作用的研究。由于多篇文章同时贡献于两个类别的数据，这些角色在以下部分独立分析以系统组织方法学和发现。在DH研究方面，20篇入选论文调查了野生犬科物种作为犬新孢子虫DH的情况。这些研究评估了10种野生犬科物种，包括澳大利亚野犬与澳洲野犬杂交的一例以及一个红狐亚种。地理分布上，10项研究在美洲进行，7项在欧洲，2项在大洋洲，1项在亚洲。研究分为两种方法学类型：自然感染模型（Natural Infection Model, NIM），涉及从环境或死亡动物（如路杀或狩猎动物）采集粪便样本；实验感染模型（Experimental Infection Model, EIM），在受控条件下用犬新孢子虫感染组织饲喂圈养犬科动物并每日采集粪便。NIM研究（14篇）中，6项研究从路杀或狩猎动物获取粪便样本，1项从圈养动物获取，5项通过样线直接从环境采集，1项使用野生动物嗅探犬，另1项从兽医医院治疗的犬科动物获取样本。EIM研究（6篇）聚焦于圈养动物，包括狐狸养殖场、动物园或保护中心。动物年龄从20天至1岁不等。仅两项设计使用家犬作为阳性感染对照。接种前，所有动物经血清学和粪便学技术确认"未感染"。感染通过饲喂小鼠、绵羊/山羊、瞪羚或牛的组织诱导。NIM论文中样本量差异极大，从1至2191份粪便样本不等，而EIM研究较为有限，范围为3至8只个体。监测最多的动物物种为红狐（Vulpes vulpes），分析了近2900份样本。粪便样本是调查卵囊排出的主要生物基质。除粪便检查外，部分作者还采集血液进行血清学分析，其他包括组织采集用于组织病理学或分子研究。在三项EIM研究中，动物在实验期末被安乐死以进行详细组织分析。EIM方案通常包括约25-33天的每日粪便采集以监测卵囊排出动态。样本保存方面，最常见方法为冷冻、冷藏或酒精保存。冷冻是自然感染研究中最常报告的保存方法，冷藏和酒精保存较少使用。七项研究在样本采集后立即处理，尤其在实验感染方法中。值得注意的是，三项研究未提供粪便样本保存程序的详细信息。诊断技术方面，研究主要依赖粪便寄生虫学技术检测卵囊。蔗糖漂浮法在NIM和EIM中均为最常用方法。其他技术包括Willis漂浮法、Ritchie沉淀法和醋酸钠-醋酸-福尔马林（SAF）固定沉淀法。卵囊浓缩的标准纯化过程包括蔗糖漂浮、收集上层和随后的水洗步骤。卵囊然后在受控温度下使用2%重铬酸钾（K2Cr2O7）或2%硫酸（H2SO4）进行孢子化。分子分析通常单独使用或与粪便学技术结合使用，包括常规、巢式、半巢式和不同实时PCR，靶向ITS1和pNc5基因组区域，Np21+/Np6+为最常用引物组。此外，还使用了小鼠生物测定和细胞培养等专业确认方法。DH确认方面，灰狼（C. lupus）通过NIM确认（Dubey等，2011），郊狼（C. latrans）（Gondim等，2004a）和澳洲野犬（C. lupus dingo）（King等，2010）通过EIM确认。这些诊断基于Neospora样卵囊的显微镜可视化，随后经分子分析确认。一只灰狼阳性粪便样本估计约有10,000个卵囊。一只实验感染郊狼在2天内排出约500个卵囊，而一只澳洲野犬在3天内排出估计1,810个卵囊。相反，在多项NIM研究中，金黄色胡狼和灰狼（Bandelj等，2023）、郊狼（Klein等，2019）、澳洲野犬杂交种（Davidson等，2022）、食蟹狐（Almeida等，2019）、潘帕斯狐（Mannise等，2021）的样本仅检出犬新孢子虫DNA阳性，显微镜下未见卵囊排出。此外，Wapenaar等（2006）在郊狼和红狐中报告了Neospora样卵囊，但后续测序显示与犬新孢子虫仅95-99%同一性。尽管20项研究调查了野生犬科动物犬新孢子虫粪便排出，证据从Neospora样卵囊报告到分子确认逐渐减少，最终仅确认三种犬属物种为DH。在暴露研究方面，67篇研究论文报告了全球野生犬科动物犬新孢子虫暴露和感染的评估。共评估19种野生犬科物种，包括一个貉亚种。地理分布显示研究主要集中于欧洲和美洲，合计占入选文章的近90%（59/67）。欧洲：67篇中30篇在该地区进行，意大利、西班牙和捷克共和国等国家研究广泛，红狐（V. vulpes）为最常采样物种。美洲：67篇中29篇在该大陆进行，分布于北美（主要针对C. latrans和C. lupus）和南美洲（常针对C. thous和Lycalopex spp.）。其他地区：亚洲仅识别5项研究，大洋洲2项，非洲2项，凸显了这些地区野生犬科动物暴露的知识空白。总体而言，在评估的19种野生犬科物种中，红狐（V. vulpes）拥有最多的文献记录，共28篇发表。研究分为两类：野生动物监测（Monitoring in Wild Animals, MWA），包括56篇文章涉及捕获或死亡野生动物；圈养动物监测（Monitoring in Captive Animals, MCA），13项工作样本采集自动物园动物、私人收藏或商业养殖场，包括实验感染研究。大多数调查（47/67）的主要目的是检测抗犬新孢子虫抗体。此外，22项调查侧重于通过组织学和/或DNA检测识别组织囊肿，包括20项MWA研究和2项MCA工作。仅两项研究同时评估抗体和组织囊肿。MWA中样本量从2至860只个体不等。26篇论文涉及捕获活体动物采血后释放。相反，32项研究从路杀或狩猎动物获取样本。血液或血清是血清学的主要来源（n=35），部分研究使用胸腔液、肺液或肌肉液等替代体液。MCA中样本量通常较小，范围为1至103。9篇论文样本来自圈养动物，4篇聚焦于实验感染模型或生物测定。血液是该类别血清学分析的唯一采样类型（n=12）。在两个类别中，组织分析以识别寄生虫存在包括检查脑、肌肉、心脏、肺和肝脏。血清学分析方面，使用了多种血清学测试单独或组合调查野生犬科动物犬新孢子虫暴露。间接免疫荧光抗体试验（IFAT）是最常用方法，在65%的血清学研究中使用的，MWA和MCA设置中均有应用。大多数应用1:50的截断滴度，常用Nc-1株作为抗原，但截断值在研究间差异很大，范围从1:25至1:400。酶联免疫吸附测定（ELISA）是第二常用血清学方法（32%的研究），包括商业竞争性ELISA（c-ELISA）、间接ELISA（i-ELISA）、iscom-ELISA和其他内部测定。因此，使用ELISA的研究间观察到显著方法学变异。其他技术使用较少，包括犬新孢子虫凝集试验（NAT）、改良凝集试验（MAT）、Western Blot（WB）和免疫层析FASTest。NAT和MAT主要用作替代筛查工具，WB通常用作确认方法。大多数研究依赖单一血清学测定推断犬新孢子虫暴露，仅有限研究纳入多种血清学方法或确认测试。因此，血清学测试的可靠性在研究间存在差异，应结合所用诊断策略谨慎解释。组织分析方面，应用分子和形态学方法确认组织中寄生虫存在。组织病理学检查在5项MWA研究和1项MCA中进行，其中4项进一步使用免疫组织化学（IHC）确认特定寄生虫阶段。分子检测方面，20项研究使用各种PCR形式识别寄生虫DNA，包括常规、巢式和实时变体，MWA和MCA设置中均有应用。体内确认方面，两项研究使用小鼠模型进行生物测定以评估寄生虫活力。血清学结果方面，报告的血清阳性率估计范围为0%至100%，物种和研究类型间差异显著。总体而言，C. lupus、C. latrans和V. vulpes中观察到较宽的血清阳性率值范围，而L. gymnocercus、L. pictus以及圈养C. lupus dingo和S. venaticus种群中记录到较高的中位值。全球分布方面，自由生活野生犬科动物研究的地理分布高度可变，大多数记录集中于欧洲、北美和南美，特别是美国和巴西。相比之下，非洲、亚洲和大洋洲的记录相对有限。讨论部分指出，本系统综述分析了20项评估野生犬科动物作为犬新孢子虫DH作用的研究，使用NIM和EIM两种方法学。结果确认郊狼（C. latrans）（Gondim等，2004a）、澳洲野犬（C. lupus dingo）（King等，2010）在实验条件下以及灰狼（C. lupus）（Dubey等，2011）在自然条件下具有粪便排出犬新孢子虫卵囊的能力。大多数研究（约80%）集中于美洲和欧洲。然而，非洲和东南亚等野生犬科动物生物多样性高的地区明显缺乏研究，限制了对森林循环的整体理解。NIM反映生态系统中卵囊释放的实际自然动态，但存在确认粪便来源物种的挑战，需要分子方法或使用野生动物检测或嗅探犬。然而，这些工具的实施显著增加研究运营成本，可能限制样本处理数量和长期监测的可行性。另一方面，EIM允许严格控制的动物饮食和粪便样本，确认卵囊排出的因果关系。尽管如此，EIM需要繁殖或捕获个体，对于不易在圈养中繁殖的物种是一项复杂任务，也引发生物伦理和动物福利问题。此外，这些研究中小样本量（3至8只个体）可能影响结果的稳健性。样本保存方面观察到明显异质性；EIM研究中以立即处理为主，NIM研究中主要使用冷冻保存。这种变异可能影响卵囊完整性和活力，从而影响粪便学和分子分析的敏感性。最广泛使用的粪便寄生虫学技术为蔗糖漂浮法，推测因其高敏感性及浓缩和保存卵囊形态的能力。卵囊排出强度方面，现有数据表明野生犬科动物卵囊产量通常较低，郊狼排出约500个卵囊，澳洲野犬在2至3天相对短时间内排出约1,810个卵囊。自然感染灰狼阳性样本估计约有10,000个卵囊。这些值显著低于家犬实验感染报告值。然而，不能仅根据排出卵囊数量评估卵囊排出的流行病学意义。如Gondim和McAllister（2022）综述，牛实验感染证明暴露于相对少量有活力犬新孢子虫卵囊可导致感染和外源性经胎盘传播。因此，即使短排出期涉及相对少量卵囊也可能促进环境污染和局部野生循环的维持。粪便学和分子结果通过实验感染或检测自然感染动物确认三种犬属物种的DH作用。相反，在多项NIM研究中，食蟹狐、潘帕斯狐和金黄色胡狼粪便中检出犬新孢子虫DNA，但显微镜未识别卵囊。这些发现可能源于环境污染或替代来源的寄生虫DNA（如摄入感染猎物导致机械通过），而非尚未确认为DH的物种真正排出卵囊。此外，仅巢式PCR后检测应谨慎解释，因该技术存在假阳性风险。迄今，仅犬属物种被明确确定为犬新孢子虫DH。这种限制可能与肠道环境特定特征有关，特别是宿主-寄生虫细胞水平相互作用使寄生虫有性繁殖成为可能。然而，犬科其他属或族的成员是否具有支持犬新孢子虫完整生活史的生物学能力仍不清楚。目前，野生犬科动物作为DH传播犬新孢子虫卵囊及由此产生的环境污染的影响似乎相对较低。在暴露研究讨论中，涵盖五大洲的研究揭示野生犬科种群犬新孢子虫暴露在亚洲、非洲和大洋洲仍显著不足，这一地理空白限制了寄生虫动态的全球外推。迄今已评估19种犬科物种暴露，红狐（V. vulpes）研究最广泛。这种研究偏倚很大程度上受物种全北界分布和官方种群控制计划提供的样本获取便利性影响。尽管红狐DH作用仍未确认，但抗体、寄生虫DNA的反复检测以及垂直传播证据表明该物种可能在维持森林循环中犬新孢子虫方面发挥重要作用。监测类别比较表明圈养种群（MCA）常显示比自由放养种群（MWA）更高的流行率估计。与MCA不同，MWA研究提供犬新孢子虫在野生动物群落中循环的更现实生态视图。圈养南美犬科动物（包括食蟹狐、潘帕斯狐、霍氏狐和丛林犬）中观察到的较高血清阳性率值可能与管理实践、较高动物密度、受限环境或喂养实践有关，这些可能促进犬新孢子虫暴露。相反，自由放养条件下调查的几种物种（如鬃狼、达尔文狐、非洲野犬和蝠耳狐）未检测到抗体。然而，这些发现应谨慎解释，因为采样和诊断测试性能差异可能解释暴露的表观缺失。血清学证据代表野生犬科动物犬新孢子虫暴露的最常见信息来源。IFAT是主要血清学技术，其次是不同ELISA。研究间识别出相当大的方法学异质性，包括测定类型、截断值和确认方法使用的差异。这种变异可能影响敏感性和特异性，从而影响已发表的血清阳性率估计。血清学发现解释也需谨慎，因为目前用于犬新孢子虫的大多数测定最初为牛和家犬开发验证，而非野生犬科物种。因此，许多野生动物宿主的测试敏感性、特异性和最佳截断值仍不确定。这一限制在比较流行率估计时尤为重要，因为观察到的差异可能反映方法学变异或流行病学模式。此外，仅少数研究使用确认方法如Western blot或多种独立血清学测试，大多数基于单一测试解释。结合筛查和确认方法的研究提供更稳健的暴露证据，因其减少测试特异性相关不确定性。还需考虑血清阳性结果解释为既往暴露证据；然而，血清阴性结果不排除感染。例如，实验感染家犬据报道可在不产生可检测抗体反应的情况下排出犬新孢子虫卵囊，表明仅血清学发现可能低估某些宿主的流行病学相关性。因此，血清学数据主要应解释为暴露指标，并尽可能与分子、组织病理学和流行病学证据结合考虑。虽然血清学反映既往接触寄生虫，分子和组织学研究识别实际感染。这使评估关键方面以确定物种作为IH的作用成为可能。在多项MWA研究中，无症状物种的CNS和肌肉组织中检测到犬新孢子虫DNA。另一方面，Yu等（2009）通过免疫组织化学（IHC）和PCR确认北极狐临床感染，识别速殖子簇和组织囊肿。然而，诊断需谨慎： sporadic occurrences of muscle cysts compatible with N. caninum have later been identified as Sarcocystis spp.（Lempp等，2017）。本综述的主要亮点是潘帕斯狐作为 competent IH（Scioscia等，2022）和红狐作为IH的证据，以及后者100%垂直传播的报告（Almería等，2002；Zanet等，2023）。这些发现表明某些种群可在无其他IH干预下内部维持寄生虫循环。综合来看，这些发现支持野生犬科动物在犬新孢子虫生活史中的双重角色，作为中间宿主的贡献更为突出。结论部分指出，本综述表明虽然C. latrans、C. lupus和C. lupus dingo被确认为犬新孢子虫DH，但关于其他野生犬科动物自然动态的重大知识空白仍然存在。NIM和EIM之间的方法学差异以及样本保存和分析的异质性给结果解释和研究间比较带来挑战。在暴露犬科动物中，证据强调需要整合诊断方法（血清学、组织病理学、IHC和PCR）以充分理解其在寄生虫生活史中的作用。未来研究应优先考虑：1）诊断技术和标准的标准化；2）扩展地理覆盖至野生犬科动物多样性高的代表性不足地区，特别是非洲、亚洲和南美洲；3）开发结合环境采样与分子确认和系统发育分析的整合性研究设计。此外，增加地理规模和评估个体数量对于加强野生犬科动物在犬新孢子虫生物循环中作用的证据至关重要。基于当前知识，野生犬科动物在犬新孢子虫流行病学中似乎作为IH的作用比作为DH更为突出。