组织表面预处理增强硫醇化聚合物基水凝胶的生物黏附性能

《International Journal of Pharmaceutics》：Enhanced bioadhesion of thiomer-based hydrogels by tissue surface pre-conditioning

　　

组织损伤部位的局部递送和长期保留仍然是再生医学和术后护理中持续存在的挑战。切除、创伤或疾病相关组织缺失后，内在修复机制通常无法在临床相关时间范围内恢复结构和功能，存在愈合延迟、屏障衰竭、感染和其他继发性并发症的风险。基于水凝胶生物墨水的生物打印技术通过实现具有高空间精度和多功能组织再生支持的活体构建体制造，正在改变再生医学。生物墨水由天然或合成聚合物水凝胶组成，可整合细胞和生物活性剂，同时提供结构支持和生物相容性。与传统体外生物打印相比，原位三维（3D）生物打印能够将生物墨水直接沉积到组织缺损处，改善解剖学贴合性并促进局部组织修复。然而，临床转化仍受限于生理条件下的打印保真度不足、机械稳定性不足，尤其是打印水凝胶与湿润生物组织之间的黏附不足。许多软组织表面的高度水合和化学惰性限制了稳定界面键的形成，导致构建体保留不良和治疗性能受损。改善水凝胶黏附的策略主要集中于调整生物材料本身，例如通过水凝胶网络的化学修饰、非生物基材的表面功能化或引入中间黏附涂层如聚多巴胺。然而，组织表面反应性结合位点的可用性同样是界面结合的重要决定因素。黏附不足不仅源于水凝胶化学的局限性，还源于天然组织上可及结合基团密度有限。为解决这一问题，本研究方法靶向生物墨水-组织界面而非仅关注材料性质，同时保持天然组织结构，从而补充传统生物材料设计。硫醇化聚合物（thiomers）是特别有吸引力的生物墨水材料，因为其硫醇基团易于参与二硫键交换和自由基介导的硫醇-烯反应，能够与生物基材共价偶联。海藻酸盐因其优异的生物相容性、可调生物降解性和在生物打印中的广泛使用而被选为水凝胶基质。与L-半胱氨酸缀合生成含侧链硫醇基团的硫醇化海藻酸盐（Alg-Cys），能够形成共价界面键。猪肠黏膜、骨骼肌和肝脏被选为具有不同结构但保守硫醇/二硫键化学的代表性组织。肠黏液含有富含半胱氨酸的分泌型和膜结合型黏蛋白。而肌肉和肝脏细胞外基质含有含二硫键的蛋白质，包括纤连蛋白、层粘连蛋白和整合素。为增加可及结合位点数量，组织表面用二硫苏糖醇（DTT）预处理，DTT是一种成熟的还原剂，可裂解二硫键并释放游离硫醇基团。随后，多功能4臂和8臂PEG-丙烯酸酯共价固定到这些新生成的硫醇上，为后续与Alg-Cys的硫醇-烯偶联提供多个侧链丙烯酸酯基团。该方法采用序贯组织活化策略，DTT介导的还原最初揭示额外的内源性硫醇基团，增加可用结合位点数量，而PEG-丙烯酸酯引发进一步通过引入多个共价连接点扩展这一反应性界面。通过将相对惰性的组织表面转化为高度功能化的黏附界面，该策略最大化共价偶联并提供增强水凝胶黏附的平台，用于原位生物打印和再生应用。

研究背景方面，组织损伤部位的生物材料局部递送和长期保留是再生医学与术后护理的持续难题。原位3D生物打印虽能直接沉积生物墨水至组织缺损处，但打印水凝胶与湿润生物组织之间的黏附不足严重制约其临床转化。现有改善黏附的策略主要聚焦于生物材料本身的设计（如水凝胶网络化学修饰、表面功能化或引入聚多巴胺等中间黏附涂层），而忽视了组织表面可及反应性结合位点密度这一界面结合的关键决定因素。天然软组织表面高度水合且化学惰性，可及结合基团有限，导致构建体保留不良。因此，研究人员提出靶向生物墨水-组织界面而非仅关注材料性质，通过组织表面预处理增强硫醇化聚合物基水凝胶的生物黏附。

研究人员开展了序贯组织活化策略研究：首先用二硫苏糖醇（DTT）还原组织表面二硫键释放游离硫醇基团，随后将多臂PEG-丙烯酸酯共价固定到新生成硫醇上以扩增反应性丙烯酸酯基团密度，最后应用硫醇化海藻酸盐（Alg-Cys）生物墨水通过硫醇-烯反应实现共价界面结合。研究得出：50 mM DTT处理30 min为兼顾高效二硫键还原与低细胞毒性的优化条件；8臂PEG-丙烯酸酯因多价性在组织表面固定化效率优于4臂类似物，在黏膜上可达应用量的89%（较未处理对照提高3.6倍）；5% Alg-Cys配以8臂PEG-丙烯酸酯的配方具有良好流变学性能（剪切变稀和快速结构恢复）；离体黏附实验证实预处理和引发步骤使水凝胶在猪肠黏膜、肌肉和肝脏上的黏附强度逐步提升，黏膜受益最为显著。该研究的重要意义在于：通过将水凝胶配方设计与靶向组织修饰相结合，为多样化组织类型改善生物界面黏附提供了通用策略，在原位生物打印等应用中具有巨大潜力。

关键技术方法方面（不超过250字）：研究人员采用改良Franz扩散池装置对猪肠黏膜、猪肩肌和猪肝组织进行DTT预处理，通过Ellman's试验和氧化型DTT光谱法量化表面游离硫醇，用荧光素-5-马来酰亚胺进行离体荧光成像验证；通过碘滴定法量化PEG-丙烯酸酯引发后固定的双键；采用EDC介导的化学缀合合成Alg-Cys，以FTIR和1H NMR表征，Ellman's法和TNBS法测定硫醇化度及残留伯胺；通过流变学（振幅扫描、频率扫描、恢复扫描）和定制挤出装置评估生物墨水打印性能；采用血溶血试验及Caco2、C2C12、HepG2细胞系进行细胞毒性和LIVE/DEAD长期活性评估；通过质构仪测定总附着强度和总黏附功。猪肠黏膜来源于当地屠宰场，猪肝和猪肩肌购自当地超市。

研究结果方面：3.1 生物学组织对DTT预处理的响应——通过Ellman's试验和荧光成像，研究人员发现DTT预处理在所有组织中引起浓度依赖性可及硫醇增加，黏膜响应最为显著（最低浓度即增加83%，最高浓度增加116%），肌肉增加46%–53%，肝脏基线硫醇反应性高（PBS对照超过1000 μmol cm?2）；通过Resazurin细胞活力试验确定50 mM DTT处理30 min为兼顾还原效率与细胞活力的优化条件。3.2 PEG-丙烯酸酯引发后的可用结合位点——通过碘滴定法，研究人员发现引发步骤保留了预处理产生的硫醇增加效果，8臂PEG-丙烯酸酯固定化密度始终高于4臂类似物，黏膜在最高DTT浓度下达到应用8臂PEG-丙烯酸酯的89%（较未处理对照提高3.6倍），50 mM DTT下固定70%（提高2.8倍）；肌肉80 mM DTT下固定75%（提高3.4倍）；肝脏50 mM DTT下固定83%（提高2.0倍）。3.3 Alg-Cys水凝胶的表征与配方——通过FTIR和1H NMR确认Alg-Cys成功合成，Ellman's法测定硫醇接枝量约1200 μmol g?1，TNBS法未检测到残留伯胺，DTT还原后游离硫醇比例显著提高。3.4 水凝胶流变学性能——通过振幅扫描、频率扫描和恢复扫描，研究人员发现5% Alg-Cys配以8臂PEG-丙烯酸酯具有最宽的线性黏弹区和最慢的G′衰减，8臂配方剪切变稀行为更明显、挤出压力更低，所有水凝胶均表现自愈合行为，未修饰海藻酸盐对照不凝胶确认硫醇-烯交联为主要机制。3.5 Alg-Cys水凝胶的细胞毒性——通过浸提液法和LIVE/DEAD染色，研究人员发现Caco2和HepG2细胞在所有配方下活力均高于70%，C2C12呈浓度依赖性响应但5% Alg-Cys配方活力显著提高；溶血试验显示最大溶血约5%；7天直接接触培养显示5% Alg-Cys配以4臂或8臂PEG-丙烯酸酯提供最佳细胞存活和增殖支持，网络形成完全性为细胞相容性关键决定因素。3.6 预处理后的黏附——通过质构仪测定总附着强度和总黏附功，研究人员发现黏膜在双侧预处理下5% 8臂PEG-丙烯酸酯配方的TAS和TWA较空白分别提高1.9倍和1.8倍，8臂PEG-丙烯酸酯较Alg-Cys单独使用提高TAS和TWA各36%和39%；肌肉双侧预处理较空白提高TAS和TWA各1.8倍和1.6倍，8臂PEG-丙烯酸酯较Alg-Cys单独提高39%和23%；肝脏8臂PEG-丙烯酸酯引发后5% Alg-Cys在双侧预处理下TWA较Alg-Cys单独提高46%。总体表明水凝胶黏附受组织硫醇可用性、表面化学、聚合物浓度和引发剂结构等多因素协同调控，且具有组织特异性。

讨论部分总结：研究证实靶向组织界面的序贯活化策略可显著增强硫醇化聚合物水凝胶的生物黏附。DTT介导的硫醇暴露具有强组织依赖性，黏膜响应最强，肌肉和肝脏呈中等但一致的增加。PEG-丙烯酸酯引发进一步扩增组织反应性，8臂PEG-丙烯酸酯因多价性优于4臂类似物。优化配方5% Alg-Cys配以8臂PEG-丙烯酸酯具有良好流变学性能支持挤出应用。离体黏附研究证实预处理和表面引发逐步增强组织黏附，改善幅度取决于组织特性。通过将水凝胶配方设计与靶向组织修饰相结合，该策略在多样化组织类型中改善生物界面黏附，在原位生物打印等应用中具有巨大潜力。

研究结论翻译：本研究证明了一种组织界面工程策略，通过靶向生物墨水-组织界面的生物学侧来改善硫醇化聚合物基水凝胶的黏附。通过DTT介导的还原序贯暴露内源性组织硫醇并通过多臂PEG-丙烯酸酯引发扩增反应性表面功能团，显著增强了半胱氨酸功能化海藻酸盐（Alg-Cys）水凝胶的黏附。Alg-Cys被成功合成，具有高硫醇含量（约1200 μmol硫醇 g?1）并表现出良好的细胞相容性。组织预处理优化确定50 mM DTT处理30 min为有效条件，在提供高效硫醇活化的同时保持低细胞毒性。DTT介导的硫醇暴露具有强组织依赖性，黏膜表现出最大响应，而肌肉和肝脏显示中等但一致的增加。随后的PEG-丙烯酸酯引发进一步增强组织反应性，8臂PEG-丙烯酸酯因其增加的多价性相比4臂类似物提供更优异的反应位点固定化。优化的5% Alg-Cys（m/V）8臂PEG-丙烯酸酯配方表现出有利的流变学性能，包括剪切变稀行为和快速结构恢复，支持其用于挤出应用的适用性。离体黏附研究证实通过预处理和表面引发逐步增强组织黏附，改善幅度取决于组织特性。黏膜组织从广泛的DTT活化中获益最大，而肌肉对预处理强度的依赖性较低，突出了组织特异性界面特性的重要性。总体而言，DTT介导的组织活化结合多臂PEG-丙烯酸酯引发提供了一种通用方法来增加组织界面的反应性结合位点并增强硫醇化聚合物基水凝胶的黏附。通过将水凝胶配方设计与靶向组织修饰相结合，该策略改善了多样化组织类型的生物界面黏附，并为原位生物打印等应用提供了巨大潜力。