巨噬细胞USF2乳酸化修饰介导的FABP4抑制促进布鲁氏菌胞内增殖的机制研究

《Transboundary and Emerging Diseases》：Macrophage USF2 Lactylation-Mediated FABP4 Suppression Promotes Intracellular Proliferation of Brucella

　　

摘要专业翻译 布鲁氏菌属（Brucella spp.）为兼性胞内菌，可感染多种哺乳动物宿主并诱发布鲁氏菌病。阐明布鲁氏菌胞内生存的分子机制，对于布鲁氏菌病的防控具有至关重要的意义。本研究揭示了流产布鲁氏菌（Brucella abortus）通过操控宿主乳酸代谢以促进其胞内增殖的分子机制。B. abortus感染巨噬细胞后，宿主巨噬细胞L-乳酸（L-lactate）生成量显著升高，进而促进细菌增殖。蛋白质组学与功能学分析鉴定出宿主葡萄糖转运蛋白Slc2a1为B. abortus增殖及宿主细胞乳酸化（lactylation）的正向调控因子。B. abortus效应蛋白SepA可上调Slc2a1表达及宿主细胞乳酸化水平。转录因子USF2第255及275位赖氨酸残基发生乳酸化修饰后，其介导的宿主脂代谢相关蛋白Fabp4表达受到抑制，从而增强细菌胞内存活能力。此外，Fabp4抑制可减弱B. abortus诱导的巨噬细胞M1型极化及脂质代谢。上述发现揭示了一个双轴调控网络，即B. abortus通过SepA/Slc2a1轴与L-乳酸-USF2/Fabp4轴劫持宿主L-乳酸代谢重编程，从而建立胞内生存生态位，为理解宿主与布鲁氏菌之间的代谢交互提供了新见解。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属（Brucella spp.）引起的人兽共患传染病，全球170余个国家均有分布。该病不仅造成畜牧业重大经济损失，还因高的人兽传播风险、人类感染的慢性迁延性及防控难度大而构成严重的全球公共卫生威胁。布鲁氏菌为兼性胞内病原菌，其在宿主巨噬细胞内的存活与增殖是感染建立和持续的关键环节。既往研究表明，布鲁氏菌感染可显著上调宿主巨噬细胞的糖酵解活性，导致包括乳酸在内的糖酵解终产物生成增加。然而，乳酸在布鲁氏菌感染宿主细胞中的具体功能，以及感染过程中宿主蛋白是否发生乳酸化修饰，此前尚不清楚。阐明布鲁氏菌如何利用宿主代谢途径构建有利于自身生存的胞内微环境，对于布鲁氏菌病的防治具有重要理论意义。

二、研究内容与主要发现

本研究以流产布鲁氏菌（B. abortus）A19疫苗株感染RAW264.7巨噬细胞为模型，系统揭示了B. abortus通过操控宿主乳酸代谢促进自身胞内增殖的双轴调控网络。研究人员发现，B. abortus感染可显著上调巨噬细胞L-乳酸生成，而外源补充L-乳酸可剂量依赖性地促进细菌胞内增殖，糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）则显著抑制细菌增殖，且上述效应均非直接作用于细菌本身，而是通过影响宿主细胞实现。进一步通过蛋白质组学分析鉴定出宿主葡萄糖转运蛋白Slc2a1为关键调控节点，B. abortus感染可显著上调其表达。功能实验证实Slc2a1过表达促进细菌增殖，而敲低则抑制细菌增殖，同时Slc2a1正向调控宿主细胞乳酸化水平。机制层面，B. abortus的IV型分泌系统（T4SS）效应蛋白SepA可通过转录因子Vezf1上调Slc2a1启动子活性，进而促进Slc2a1表达和细胞乳酸化。

在乳酸促进细菌增殖的下游机制研究中，蛋白质组学分析鉴定出脂代谢相关蛋白FABP4为关键靶点。B. abortus感染可上调FABP4表达，而L-乳酸处理则显著抑制其表达。功能实验表明FABP4过表达抑制细菌胞内增殖，FABP4敲低则促进细菌增殖，提示FABP4为宿主限制B. abortus增殖的重要防御因子。在转录调控层面，研究人员通过启动子截短分析和定点突变鉴定出USF2为FABP4的核心转录激活因子，EMSA实验证实USF2可直接结合FABP4核心启动子区域。进一步研究发现，B. abortus感染可增强USF2的赖氨酸乳酸化修饰，其中第255和275位赖氨酸为关键乳酸化位点。将上述位点突变为丙氨酸后，USF2对FABP4启动子的转录激活能力显著增强，表明USF2乳酸化修饰抑制其转录活性，从而降低FABP4表达。

在宿主免疫与代谢层面，研究发现L-乳酸可显著抑制B. abortus诱导的巨噬细胞M1型极化，表现为IL-1β、IL-6、iNOS、TNF-α及CD86表达下调，FABP4敲低可模拟该效应。此外，L-乳酸通过抑制FABP4减少脂滴形成和甘油三酯（TG）积累，而油酸诱导脂滴生成可抑制B. abortus胞内增殖。USF2及其乳酸化缺陷突变体的功能实验进一步证实，USF2通过调控FABP4影响巨噬细胞M1极化、脂滴形成及B. abortus胞内增殖。

三、关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：比较蛋白质组学分析（质谱数据已提交至ProteomeXchange数据库，编号PXD063435，用于鉴定差异表达蛋白及乳酸化修饰靶点）；sepA基因缺失突变株（ΔSepA）及回补株（C-ΔSepA）的构建（用于验证效应蛋白SepA的功能）；双荧光素酶报告基因实验（用于鉴定Slc2a1和FABP4启动子核心调控区域及转录因子结合位点）；凝胶迁移实验（EMSA，用于验证USF2与FABP4启动子的直接结合）；免疫共沉淀（Co-IP，用于检测USF2乳酸化修饰水平）；Western blotting、qRT-PCR、RNA干扰（siRNA）、流式细胞术及免疫荧光染色（用于检测蛋白表达、细胞因子水平、巨噬细胞极化标志物及脂滴形成）。

四、研究结果

3.1 L-乳酸增强巨噬细胞中B. abortus的胞内增殖：B. abortus感染RAW264.7细胞后，胞内L-乳酸水平在24小时感染时间点（hpi）显著升高，细胞整体乳酸化水平呈时间依赖性上升。外源补充10或20 mM L-乳酸可显著促进细菌胞内增殖，而2 mM 2-DG处理则显著抑制细菌增殖。体外培养实验排除了L-乳酸和2-DG对细菌的直接杀伤作用，证明L-乳酸通过影响宿主细胞促进细菌增殖。

3.2 B. abortus通过效应蛋白SepA调控宿主糖酵解蛋白Slc2a1以促进细胞乳酸化：比较蛋白质组学分析鉴定出Slc2a1为差异表达最显著的糖酵解相关蛋白。Slc2a1过表达促进B. abortus增殖并增强细胞乳酸化，敲低则产生相反效应。效应蛋白筛选发现SepA可特异性上调Slc2a1表达，ΔSepA突变株感染显著削弱Slc2a1诱导和宿主细胞乳酸化能力。机制研究表明SepA通过转录因子Vezf1调控Slc2a1启动子活性。

3.3 L-乳酸通过抑制宿主FABP4蛋白增强B. abortus在巨噬细胞中的增殖：B. abortus感染上调FABP4表达，而L-乳酸处理抑制该上调效应。FABP4过表达显著抑制B. abortus、ΔSepA及C-ΔSepA的胞内增殖，FABP4敲低则显著促进细菌增殖，表明FABP4为宿主限制细菌增殖的负调控因子。

3.4 宿主转录因子USF2调控FABP4启动子活性：启动子截短分析将FABP4核心启动子定位于转录起始位点上游-100至-1区域。定点突变实验表明USF1/USF2结合位点突变可完全消除FABP4启动子活性。USF2过表达显著增强FABP4启动子活性，EMSA证实USF2可直接结合FABP4核心启动子区域，而USF1无此结合活性。

3.5 B. abortus调控转录因子USF2的赖氨酸乳酸化修饰：B. abortus感染及外源L-乳酸处理均可增强USF2的赖氨酸乳酸化水平，ΔSepA感染对USF2乳酸化的诱导作用显著弱于野生株和回补株。定点突变鉴定出USF2第255和275位赖氨酸为主要乳酸化位点，K255A和K275A突变体对FABP4启动子的激活能力显著强于野生型USF2。

3.6 L-乳酸可能通过抑制FABP4调控B. abortus诱导的巨噬细胞M1型极化：L-乳酸处理显著下调B. abortus感染的RAW264.7细胞中IL-1β、IL-6、iNOS、TNF-α和CD86的表达，FABP4敲低可模拟该效应，而对M2型标志物TGF-β和ARG1无显著影响。ΔSepA感染组中IL-1β、IL-6和iNOS表达显著高于野生株感染组。

3.7 L-乳酸通过调控FABP4抑制B. abortus诱导的巨噬细胞脂滴形成：B. abortus感染促进脂滴形成，ΔSepA感染组脂滴形成更为显著。L-乳酸处理及FABP4敲低均可抑制B. abortus诱导的脂滴形成和TG积累，FABP4过表达则促进TG生成。油酸诱导脂滴生成可抑制B. abortus胞内增殖。

3.8 USF2赖氨酸乳酸化修饰调控巨噬细胞M1型极化和脂滴形成：USF2过表达上调M1型细胞因子IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-α的mRNA水平，USF2-K255A和USF2-K275A突变体的促进作用更为显著。USF2过表达促进脂滴形成，乳酸化缺陷突变体的促进作用更强。USF2及其突变体过表达均可抑制B. abortus胞内增殖，其中突变体的抑制作用更强。

五、讨论与结论

本研究揭示了B. abortus利用宿主乳酸代谢重编程建立胞内感染生态位的双轴调控网络。在SepA/Slc2a1轴中，B. abortus通过T4SS分泌效应蛋白SepA，经转录因子Vezf1上调宿主葡萄糖转运蛋白Slc2a1表达，增强糖酵解通量，促进L-乳酸合成。在L-乳酸-USF2/FABP4轴中，升高的L-乳酸增强转录因子USF2第255和275位赖氨酸的乳酸化修饰，抑制USF2对FABP4启动子的转录激活能力，导致FABP4表达下调。FABP4表达的抑制进而减弱巨噬细胞M1型极化和脂滴形成，为B. abortus胞内增殖创造了有利的微环境。

研究结论：B. abortus通过效应蛋白SepA上调宿主Slc2a1表达，促进L-乳酸合成，进而通过USF2赖氨酸乳酸化修饰抑制FABP4表达，削弱巨噬细胞M1极化和脂质代谢，最终促进细菌胞内增殖。该发现揭示了宿主与布鲁氏菌之间代谢交互的新机制，为布鲁氏菌病的防治提供了新的理论依据和潜在干预靶点。

需要指出的是，本研究存在一定局限性：所有实验均基于RAW264.7巨噬细胞系开展，未能完全模拟体内复杂环境；SepA突变株的毒力和FABP4表达变化未在小鼠感染模型中验证。未来需利用骨髓来源巨噬细胞（BMDM）和小鼠感染模型进一步确证体内相关性。此外，在自然宿主的胎盘滋养层细胞中，布鲁氏菌的碳代谢以磷酸戊糖途径（PPP）和赤藓糖醇利用为主，本研究发现的乳酸化机制是否在该自然生态位中发挥作用尚待验证，但在巨噬细胞丰富的慢性感染阶段或急性菌血症期，Warburg样糖酵解重编程及后续乳酸化修饰更可能构成有意义的调控层面。