2018–2023年中国新型鸭正呼肠孤病毒的基因组重组与遗传多样性研究

《Transboundary and Emerging Diseases》：Genomic Recombination and Genetic Diversity of Emerging Novel Duck Orthoreovirus in China, 2018–2023

　　

新型鸭正呼肠孤病毒（NDRV）是严重影响中国水禽养殖业的主要病原体，但其进化动态和重配模式仍不明确。在本研究中，研究人员对2018–2023年从山东省和江苏省分离的10株NDRV毒株进行了全基因组测序，并通过序列同源性、系统发育学和重组检测分析了其遗传特征。研究人员还通过静脉注射评估了三个代表性毒株对1日龄雏鸭的致病性。结果显示，所有基因片段的核苷酸（nt）同源性范围为86.9%至99.9%，并且在本研究的分离株中，L2、M1、S2和S4片段比传统高变S1基因表现出更大的序列变异。研究人员在XT18毒株的M2片段（以SDYC和HN5d为亲本毒株）和LY20毒株的S4片段（以GX-Y7和SDYC为亲本）中鉴定出重组事件，据研究人员所知，这代表了NDRV M2和S4片段中首次报道的重组。在致病性测试中，SDYC毒株诱导了最严重的脾脏病变，并在体内维持了最高的病毒载量。总体而言，这些发现阐明了当前流行NDRV毒株的分子进化和重配格局，并为选择疫苗候选株和设计精准防控策略提供了科学依据。

论文解读：2018–2023年中国新型鸭正呼肠孤病毒的基因组重组与遗传多样性

研究背景与目的

新型鸭正呼肠孤病毒（NDRV）已成为严重威胁中国水禽养殖业的主要病原体，主要感染雏鸭，引起脾脏肿大坏死、肝脏出血性坏死及跗关节肿胀，发病率和死亡率较高。更为关键的是，NDRV可诱发免疫抑制，增加继发感染风险，导致生长迟缓和饲料转化率下降。自2017年起，如XT18等变异毒株的出现进一步推高了发病率和死亡率。从分类上看，NDRV属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）正呼肠孤病毒属（Orthoreovirus），其基因组由10个双链RNA（dsRNA）节段组成，按分子量分为大（L1–L3）、中（M1–M3）、小（S1–S4）三组。尽管已有全基因组测序数据的积累，但目前对于特定基因组合如何决定病毒毒力和病理型的精确机制仍不完全清楚。此外，NDRV宿主范围持续扩大，跨种传播风险带来新的挑战，因此亟需对其分子进化和重配模式进行深入研究。本研究旨在通过对2018–2023年间分离的NDRV毒株进行全基因组测序、系统发育分析和重组检测，阐明其遗传特征、进化关系及致病性差异，为疫苗选择和精准防控提供科学依据。

研究方法

研究人员从2018年至2023年间采集自山东、江苏等地大型养殖场的疑似患病鸭（4–18日龄）的脾脏和肌腱样本中，经PCR检测阳性后，在LMH细胞（Leghorn Male-chicken Hepatocellular-carcinoma，ATCC CRL-2117）上进行病毒分离，最终获得10株NDRV分离株。关键技术方法包括：采用HiSeq平台进行病毒全基因组测序与de novo组装；利用DNASTAR和BLASTN进行序列同源性分析；使用MEGA V7.0软件以邻接法（neighbor-joining）构建系统发育树，并通过1000次bootstrap重复评估节点置信度；运用mVISTA在线平台进行全基因组可视化比对分析；采用重组检测程序RDP5（Version 5.5）和相似性作图（Simplot）进行重组信号扫描，同时应用RDP、GENECONV、MaxChi、Chimaera、SiScan、LARD和3Seq七种检测算法，仅当至少五种算法检测到且p值<10^?14时才认定为可信重组事件；最后，通过静脉注射相同剂量（10⁵ TCID₅₀/只）的方式，将三个代表性NDRV分离株（XT18、SDLS和SDYC）接种至1日龄樱桃谷雏鸭，进行脾脏致病性分析，并使用TaqMan探针实时荧光定量PCR测定病毒载量。

研究结果

3.1 分离株的基因组特征：研究人员分析了2018–2023年间分离的10株NDRV毒株，其中8株为新测序。组装的全长基因组为23,418 bp，包含10个线性dsRNA片段，长度从1191 bp（S4）到3959 bp（L1）。所有片段两端均具有ARV物种特异性保守末端序列（5′-GCUUUU和3′-UCAUC）。除三顺反子S1基因外，其余九个片段均为单顺反子，共编码12种病毒蛋白，编码分配与其他已知NDRV毒株一致。

3.2 序列同源性分析：在所有片段中，研究人员分离株间的核苷酸（nt）同源性为86.9%–99.9%，氨基酸（aa）同源性为94.8%–100.0%。然而，不同片段间变异程度差异显著。L2（nt 93.3%–95.3%）、M1（nt 94.3%–97.1%）、S2（nt 86.9%–96.4%）、S3（nt 95.3%–98.2%）和S4（nt 93.9%–97.2%）片段的nt同源性相对较低。值得注意的是，传统上被认为是高变区的σC编码基因（S1）在本研究中nt和aa同源性分别为97.2%–99.6%和97.2%–99.7%，并未表现出预期的高变异性。这表明除传统高变S1基因外，L2、M1、S2和S4等片段在当前流行的NDRV毒株中也蕴藏着显著的序列多样性。以SDYC毒株为例，其不同基因片段与不同来源毒株（如XT18和SDWF21）显示出最高序列同源性，这种镶嵌分布为NDRV进化过程中频繁发生重配提供了新证据。

3.3 系统发育分析：基于所有10个片段nt序列构建的系统发育树显示，总体上，本研究分离株与参考NDRV毒株的L和M基因聚为一簇，与经典DRV、番鸭正呼肠孤病毒（MDRV）和鹅正呼肠孤病毒（GRV）有明显遗传分化。然而，某些NDRV毒株在特定片段上与经典毒株聚类紧密。例如，SD19-6201毒株在L1基因上与DRV分离株TH11紧密聚类；JS0122毒株在多个基因片段（L1、L2、M1和M2）上与MDRV分离株J18紧密聚类，但在其余基因片段上与其他NDRV毒株遗传距离较远。这种片段特异性系统发育树之间的拓扑结构不一致性表明，JS0122可能源于NDRV和MDRV谱系之间的重配。在S1位点，除JS0122和SD19-6201外的所有NDRV毒株形成一个高度聚集的群体。而在S2、S3和S4基因上，某些NDRV毒株形成了独立的系统发育谱系，即SDYC（S2）、JS0122（S3）和SDLH23（S4），这也可能反映了这些片段中的重配或强烈的谱系特异性选择。

3.4 全基因组可视化分析：通过mVISTA进行的全基因组同源性比较显示，整体相似性很高，表明NDRV基因组高度保守。然而，在不同毒株的L2、M1、S2和S4片段中观察到显著变异（同源性<95%），指出了局部突变热点。包括GX-Y7、SD19-6201和SDWF21在内的几个毒株在多个片段上显示出与主群一定程度的序列差异。

3.5 氨基酸变异分析：在λB、μA、σA和σNS四种蛋白中，已知的功能基序（如λB中的RNA聚合酶基序和σA中的dsRNA结合活性位点）保持完整，未检测到aa替换或缺失。相比之下，σC蛋白表现出显著的aa序列多样性。在其抗原结合区和细胞受体结合区内，新分离毒株SDYC、SDWF21、LY20、JS0122、SDLH23和SDZB23均存在不同程度的aa突变。值得注意的是，JS0122和ZSS-FJ20在多个位置上共享高度一致的aa替换模式。进一步分析发现，σC蛋白的aa 85–158区域构成一个高变结构域。

3.6 重组分析：重组分析揭示XT18和LY20毒株各携带一个片段内重组事件。具体来说，XT18的M2片段被鉴定为重组序列，以SDYC为主要亲本，HN5d为次要亲本；LY20的S4片段同样为重组体，以GX-Y7为主要亲本，SDYC为次要亲本。所有这些重组事件均满足至少五种重组算法检测阳性且p值<10^?14的统计标准，而其他片段中未检测到可靠的重组信号。

3.7 脾脏致病性分析：雏鸭脾脏致病性分析显示，XT18感染引起的脾脏病变相对轻微，仅有散在坏死灶。相比之下，SDLS和SDYC分别在感染后7天（dpi）和5 dpi引起严重的脾脏坏死，坏死病变几乎覆盖整个脾脏表面。组织病理学检查揭示了三种毒株在脾脏损伤程度和进展上的显著差异。XT18致病性最弱；SDLS呈现脾髓充血、纤维素样渗出和淋巴细胞坏死；SDYC表现出最严重的脾脏病理变化，包括严重的脾髓充血和广泛纤维素样渗出，组织坏死崩解，肉芽肿形成，最终坏死区被纤维组织取代，病变持续时间最长。动态病毒载量监测显示，在中后期，SDYC维持相对较高的病毒载量，在7 dpi时显著高于XT18（p=0.028），在13 dpi时显著高于XT18和SDLS（p=0.0003和p=0.0006），表明SDYC可能在脾脏中具有更强的持续复制适应能力。

讨论与结论

该研究首次报道了NDRV中M2和S4片段的重组事件及其亲本来源，并揭示了不同NDRV分离株间显著的致病性差异。研究确认了L2、M1、S2和S4作为可变热点基因，并在XT18的M2基因和LY20的S4基因中发现了统计学上显著的重组事件。这些发现丰富了NDRV的分子流行病学数据，并为理解病毒进化与致病性之间的机制联系奠定了基础。研究人员指出，不同NDRV基因片段可能承受不同的选择压力，L2、M1、S2和S4成为新的多样性富集区域。片段内重组和片段间重配共同促进了正呼肠孤病毒的进化。值得注意的是，在本研究中被证实为最强致病性的SDYC毒株，同时也是两个重组事件中的亲本毒株，而已知HN5d毒株的σC蛋白存在与高致病性相关的18个氨基酸缺失。这些高致病性毒株遗传物质的整合是否直接影响XT18和LY20的致病特性值得进一步研究。NDRV的宿主范围持续扩大，遗传重配可能是驱动这一扩大的关键因素。未来应重点关注NDRV传播链的持续监测，特别是宿主范围动态和跨种传播事件，并加强养殖场生物安全措施以减少混合感染，从而从源头上降低病毒重配事件的发生。