一种研究FGFR2融合驱动胆管癌的新型临床前免疫健全小鼠平台及其免疫抑制微环境与治疗敏感性研究

《JHEP Reports》：A novel preclinical platform to study FGFR2 fusion-driven cholangiocarcinoma☆

　　

背景与目的：FGFR2融合是肝内胆管癌（iCCA）中最常见的遗传改变。然而，FGFR抑制剂（FGFRi）的临床应答并不理想。一个主要限制是临床前模型无法模拟人类FGFR2驱动iCCA的免疫生物学特征。研究人员开发了一种原位发生且免疫健全的FGFR2融合驱动小鼠模型。 方法：采用流体动力学尾静脉注射（HTVI）方法，研究人员构建了携带FGFR2-PPHLN1融合（含或不含V565F耐药突变）并联合活化YAP1的小鼠模型，并建立了2D细胞系和3D类器官。研究人员利用bulk和单细胞RNA测序（n=3）、光谱流式细胞术（n=3-7/组）对肿瘤进行表征，并使用411例人类样本进行跨物种分析。研究人员使用抗小鼠Ly6G抗体在体内清除肿瘤相关中性粒细胞（TAN）。研究人员进行了FGFRi和抗PD-L1的体外和体内药物治疗。 结果：FGFR2驱动的小鼠肿瘤在分子和免疫学上与人类iCCA相似，表现为TAN的选择性蓄积和T细胞浸润受损。单细胞RNA测序（scRNA-seq）鉴定出促肿瘤和免疫调节性TAN亚群，而体内TAN清除显著延长了生存期（log-rank p=0.009）并导致CD8+ T细胞浸润增加（p=0.007）。3D类器官重现了对不可逆FGFRi的临床应答，同时在存在V565F突变的情况下对可逆抑制剂derazantinib表现出持续应答（IC50=5.190 μM）。体内derazantinib减少了肿瘤数量（未校正p=0.03）并边缘性延长了生存期（未校正p=0.052），而抗PD-L1无论单用还是联合均未检测到统计学显著的获益。 结论：该小鼠模型忠实再现了人类疾病的免疫生物学和治疗敏感性。种内和跨物种分析提示，FGFR2融合在塑造“冷”肿瘤微环境（TME）中发挥关键作用，并在人类和小鼠中均表现为TAN的选择性蓄积。 意义与启示：本研究开发了一个具有临床相关性的FGFR2驱动iCCA小鼠模型，可用于未来转化研究。促肿瘤和免疫调节性TAN的蓄积以及对免疫检查点抑制剂（ICI）的敏感性较差，提示需要设计利用这些肿瘤独特免疫抑制特性的替代策略。

研究背景与问题：肝内胆管癌（iCCA）是一种罕见但高度致死的小胆管肿瘤，全球发病率约为每年每10万人0.3–6例，早期多无症状，常在转移后确诊，晚期患者中位生存期仅13个月，超过70%的患者对标准化疗联合免疫检查点抑制剂（ICI）方案无应答。约15–20%的iCCA患者存在FGFR2激活，其中近80%为融合，迄今已鉴定70余种融合伴侣，融合导致激酶组成性活化。基于两项II期研究，pemigatinib和infigratinib获FDA加速批准用于携带FGFR2改变的晚期iCCA，客观缓解率（ORR）分别为36%和23%，但生存获益仅2–4个月，原发性和获得性耐药迅速出现，凸显FGFRi单药治疗的“临床低效”。已有小样本研究提示FGFR2融合驱动的人类iCCA具有CD8⁺ T细胞少、多形核髓源性抑制细胞高的独特肿瘤微环境（TME）。然而现有FGFR2融合驱动iCCA的临床前模型多为人类细胞系和患者来源异种移植（PDX）模型，缺乏免疫健全宿主环境；已有两个免疫健全小鼠模型将FGFR2融合与KRAS^G12D突变及TP53缺失联合，而FGFR2融合在人类iCCA中极少与KRAS和TP53突变共存。因此，研究人员亟需建立能真实再现人类FGFR2驱动iCCA免疫生物学特征、且遗传背景更贴近人类疾病的免疫健全模型，以阐明FGFR2融合的免疫调节作用并探索更有效的联合治疗策略。

研究内容与结论：研究人员利用流体动力学尾静脉注射（HTVI）和Sleeping Beauty转座子系统，构建了过表达人FGFR2-PPHLN1融合（含或不含V565F耐药突变）联合活化YAP1的免疫健全小鼠模型，并衍生出2D细胞系和3D类器官。研究发现该模型产生的肿瘤在分子和免疫学上均与人类FGFR2融合驱动iCCA高度相似，表现为“冷”肿瘤特征，即T细胞浸润减少而肿瘤相关中性粒细胞（TAN）选择性蓄积；单细胞RNA测序（scRNA-seq）鉴定出促肿瘤和免疫调节性TAN亚群，体内清除TAN可显著延长生存期并增加CD8⁺ T细胞浸润；3D类器官重现了临床对可逆与不可逆FGFRi的敏感性差异；体内derazantinib单药可减少肿瘤数量并边缘性延长生存期，但未能重塑TME，抗PD-L1单用或联合均无显著获益。该研究建立了一个快速、遗传可塑、免疫健全的临床前平台，揭示FGFR2融合塑造以TAN蓄积为特征的免疫抑制性“冷”TME，并提示靶向TAN的替代免疫治疗策略的必要性。

关键技术方法：研究采用HTVI联合Sleeping Beauty转座子系统在C57BL/6小鼠肝脏原位过表达FGFR2-PPHLN1（及FGFR2^V565F-PPHLN1、FGFR2-BICC1）与YAP1^S127A，建立原位免疫健全小鼠模型并衍生2D细胞系与3D类器官；采用bulk RNA测序与scRNA-seq（n=3）、光谱流式细胞术（n=3–7/组）、多重免疫荧光及免疫组化进行免疫基因组表征；体内使用抗小鼠Ly6G抗体清除TAN；体外及体内使用FGFRi（pemigatinib、futibatinib、derazantinib）与抗PD-L1治疗。人类样本队列包括内部MSSM队列（GSE33327）和Fu-China队列（OEP001105，n=255），跨物种分析共使用411例人类样本，免疫解卷积采用CIBERSORTx。

研究结果：（1）新型FGFR2融合驱动小鼠模型的建立：通过比较FGFR2-PPHLN1与多种常见共发遗传改变的组合，发现仅与活化YAP1共注射可在C57BL/6小鼠中形成纯iCCA，中位潜伏期9–10周，中位结节数19个/只（范围7–40），穿透率90%；FGFR2^V565F-PPHLN1/YAP1模型肿瘤负荷与组织学相似（中位17个结节，穿透率100%），而FGFR2-BICC1/YAP1在130天内未成瘤。Western blot证实融合蛋白表达及组成性活化，CK7与HEP-PAR1染色确认iCCA表型。由此揭示FGFR2融合与YAP1通路的致癌协同作用。（2）FGFR2融合在小鼠和人类iCCA中塑造独特免疫TME：光谱流式细胞术显示FGFR2驱动模型中总T细胞、CD4⁺、CD8⁺ T细胞、调节性T细胞（Treg）、NK细胞和B细胞显著减少，巨噬细胞、单核细胞及TAN增加，其中TAN增加为FGFR2融合驱动模型所特有并经免疫组化（IHC）确认；与内源性染色体易位来源的类器官模型比较，两者均呈TAN蓄积和相当的CD8⁺ T细胞比例；Fu-China队列CIBERSORTx解卷积及MSSM队列ssGSEA分析证实人类FGFR2融合iCCA同样存在TAN蓄积。由此得出小鼠与人类FGFR2驱动iCCA均为TAN选择性蓄积的“冷”肿瘤，且与融合伴侣无关。（3）跨物种分析支持新模型的转化相关性：bulk RNA测序基因集富集分析（GSEA）显示FGFR2驱动肿瘤富集于上皮–间质转化（EMT）、炎症相关通路、细胞周期和缺氧，健康肝脏富集代谢通路，YAP1/AKT1肿瘤富集β-catenin和NOTCH信号；Submap分析显示小鼠FGFR2驱动iCCA在转录组上更接近携带FGFR2融合的人类iCCA（Fisher精确检验p=0.03）；促肿瘤TAN特征基因在FGFR2驱动肿瘤中过表达，Ido1及Cxcl3、Cxcl5与其受体Cxcr2位列前10位失调基因。由此确认模型与人类疾病的分子相似性并提示TAN招募相关候选基因。（4）TAN在FGFR2驱动iCCA中发挥促肿瘤和免疫调节作用：对3例独立肿瘤20,342个细胞进行scRNA-seq，鉴定13种主要细胞类型，TAN为最丰富的髓系群体；依据功能标志物注释出活化型（Retnlg⁺Lcn2⁺）、Adrb2⁺型、缺氧型、干扰素（IFN）应答型、髓系样、核糖体型和炎症型TAN亚群，活化型与炎症型最为丰富；RNA velocity预测由活化型向炎症型再向缺氧型TAN的转变；CellPhoneDB分析显示活化型和炎症型TAN主要与胆管细胞、肿瘤细胞和内皮细胞互作，涉及促进转移、侵袭、增殖、EMT和免疫逃逸的配体–受体对（如SEMA4D-PLXNB1、LPAR2-ADGRE5、ANXA1-FPR1/FPR3、CD276-TREML2），缺氧型TAN与肿瘤细胞间存在VEGFA-NRP1/2轴；TAN与T细胞间存在CCL5-CCR1、TH1-ADGRE5、CD44-TYROBP及SEMA4D-PTPRC等互作。体内抗Ly6G清除TAN耐受良好，显著延缓肿瘤进展并延长生存期（中位77天对106天，log-rank p=0.009），光谱流式及多重免疫荧光显示瘤内CD8⁺ T细胞比例增加（p=0.007），CD4⁺ T细胞比例升高但未达显著，CD8⁺CD69^-PD1⁺亚群非显著增加（p=0.09），Treg显著增加（p=0.03）。由此证明TAN蓄积促进肿瘤生长并阻断CD8⁺ T细胞浸润。（5）FGFR2驱动模型及其衍生物重现临床敏感性和免疫治疗耐药：从肿瘤建立2D细胞系和3D类器官，FGFR2^V565F-PPHLN1/YAP1肿瘤仅能建立3D类器官；Western blot确认融合蛋白表达及组成性活化；72小时活力试验显示2D细胞系对futibatinib和derazantinib较3D类器官更敏感，pemigatinib在2D中未达IC₅₀；V565F突变使3D类器官对可逆FGFRi pemigatinib耐药（IC₅₀由21升至95 μM），不影响futibatinib（IC₅₀分别为11 μM与8 μM），部分影响derazantinib（IC₅₀由2.65升至5.2 μM）。体内短期4周治疗中，derazantinib单药减少结节数（未校正p=0.03）和肿瘤增殖（未校正p=0.02），肿瘤面积抑制呈非显著趋势，联合抗PD-L1无额外获益；derazantinib未重塑TME，Ly6G⁺细胞浸润无明显变化，CD8⁺细胞反而减少。生存实验中derazantinib单药呈非显著生存趋势（未校正p=0.052），联合组获显著生存获益（未校正p=0.02），两组间无显著差异，抗PD-L1未提供统计学显著额外获益。由此证实模型重现FGFRi临床敏感性，而FGFR抑制不能使肿瘤对PD-L1阻断致敏。

讨论与结论：讨论指出，现有FGFR2驱动iCCA临床前模型包括人类2D细胞系、PDX、可移植小鼠类器官及基于KRAS^G12D与TP53缺失的原位模型，均存在缺乏免疫健全宿主、绕过自发肿瘤转化过程或遗传背景与人类疾病不符等局限。本研究模型具有成瘤快、穿透率高（90–100%）、重现人类中FGFR2融合与YAP1的致癌协同、遗传可塑可模拟获得性耐药、并在免疫健全宿主中再现癌变全过程等优势；其肿瘤虽起源于肝细胞（HTVI模型的已知特征与局限），但在组织学、免疫组成和治疗应答上与胆管细胞类器官模型高度相似。研究首次结合单细胞分析与体内功能实验证明TAN的促肿瘤作用，TAN约占全部CD45⁺细胞的50%，与既往小样本空间免疫表型研究（CD11b⁺CD15⁺粒细胞占46%）一致，并获得300余例iCCA样本跨物种分析支持。讨论认为，其他肿瘤中FGFR抑制的免疫调节作用在iCCA中未获重现，本研究的免疫基因组表征提示FGFR2融合iCCA的免疫“冷”特性及TAN的免疫抑制作用可解释其对ICI的原发性耐药；CD276-TREML2、SEMA4D-PTPRC轴及Ido1、CXCR1/2等为潜在治疗靶点，靶向TAN招募或重编程的免疫治疗可能更有效地使iCCA对ICI致敏。研究结论为：本研究描述了一个用于iCCA转化研究的新型临床前平台，免疫学表征及大规模跨物种分析揭示了FGFR2融合的免疫调节作用，支持模型的临床相关性，并为针对该亚组iCCA患者新发现脆弱性的新型免疫治疗临床前测试开辟了新途径。