《RSC Chemical Biology》：BODIPY-tagged β-lactams as selective quenched activity-based probes to target human neutrophil elastaseOpen Access
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活性探针（ABPs）是探究蛋白酶功能不可或缺的工具，而淬灭型荧光变体可实现酶活性的动态实时成像。尽管取得了这些进展，针对丝氨酸蛋白酶的淬灭型活性探针（qABPs）报道极少，而丝氨酸蛋白酶是最大且最多样的机制类别蛋白酶。β-内酰胺已被广泛用于开发设计为结合或被丝
活性探针（ABPs）是探究蛋白酶功能不可或缺的工具，而淬灭型荧光变体可实现酶活性的动态实时成像。尽管取得了这些进展，针对丝氨酸蛋白酶的淬灭型活性探针（qABPs）报道极少，而丝氨酸蛋白酶是最大且最多样的机制类别蛋白酶。β-内酰胺已被广泛用于开发设计为结合或被丝氨酸依赖性细菌酶水解的分子工具和药物。在此，研究人员报道了首个含单环β-内酰胺的qABPs用于检测丝氨酸蛋白酶。酶触发的激活机制和探针的固有反应性均高度依赖于BODIPY-FL荧光团和淬灭基团在β-内酰胺核心上的相对位置。表现出最有效turn-on机制的qABPs被证明能在不同人类细胞裂解物中选择性靶向人中性粒细胞弹性蛋白酶（HNE）。最成功的qABP被快速内化并在U937细胞和人中性粒细胞中靶向HNE。这些结果证明了模块化β-内酰胺弹头在开发turn-on探针以追踪活细胞中中性粒细胞丝氨酸蛋白酶的潜力。
研究背景方面，丝氨酸水解酶是一个庞大的酶超家族，在哺乳动物、细菌和病毒的生物学过程中发挥关键功能。然而，许多丝氨酸水解酶在多种疾病发生发展中的作用仍表征不足。人中性粒细胞弹性蛋白酶（HNE）是胰凝乳蛋白酶家族的丝氨酸水解酶，表达于多形核中性粒细胞中，与囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病和急性呼吸窘迫综合征等肺部疾病相关。近期研究还报道HNE存在于肿瘤微环境中，促进肿瘤生长和转移。然而，由于缺乏选择性化学工具来研究酶在细胞和组织中的定位和动态变化，HNE释放到肿瘤微环境中对癌症进展的影响仍很大程度上未被探索。活性探针（ABPs）是用于化学蛋白质组学和细胞成像的小分子工具，包含与催化氨基酸残基共价反应的亲电基团和用于检测和富集探针标记酶的报告标签。ABPs的选择性强烈依赖于目标酶最佳分子识别所需的结构基序和弹头的固有反应性。含荧光团标签的ABPs可实现灵敏的凝胶可视化和酶活性的荧光成像。然而，探针固有荧光产生的背景信号阻碍了ABPs在实时成像中的成功应用。淬灭型ABPs（qABPs）通过将荧光淬灭基团作为离去基团掺入来解决这一问题。虽然针对半胱氨酸蛋白酶的qABPs已较为成熟，但针对丝氨酸水解酶（包括HNE）的qABPs仍很大程度上未被充分探索。现报道的HNE荧光探针存在荧光团释放到溶液中不适于凝胶实验、多荧光团/淬灭剂对增加分子量、肽链接头增加结构复杂性和合成难度等问题。单环β-内酰胺是一类窄谱β-内酰胺抗生素，具有独特的单环结构，通过与青霉素结合蛋白中保守的活性位点丝氨酸残基反应发挥活性。单环β-内酰胺部分也被用于抑制人类丝氨酸水解酶，包括HNE和二肽基肽酶8和9。研究人员报道了首个以单环β-内酰胺为弹头并具有新型turn-on机制的qABPs，这些探针表现出对HNE的强抑制和高选择性，能够在复杂蛋白质组中检测HNE。
研究人员开展的研究包括探针设计与合成、光物理性质与酶激活评估、目标选择性测试以及细胞摄取和分子对接研究。得出的结论是：所开发的qABPs具有高淬灭效率（ΦF值低于20%），激活后增加至92%；探针在生物介质和复杂蛋白质组中选择性靶向HNE，无需肽链接头进行分子识别；探针在三种不同细胞系中（含和不含HNE加标）以及人中性粒细胞裂解物中展示了有效检测和激活；探针22被快速内化并在U937细胞和人中性粒细胞中靶向HNE。这项研究的重要意义在于为研究HNE在肿瘤微环境中的作用提供了一组多功能化学工具，并支持其作为癌症治疗相关靶点的验证。
在技术方法方面，研究人员采用了以下主要关键技术方法：化学合成策略（包括Barbier型反应、铜催化叠氮-炔环加成点击反应等）制备两类qABPs；光物理性质评估（荧光量子产率测定、紫外-可见分光光度法监测碱性水解）；酶激活实验（使用猪胰弹性蛋白酶PPE和人中性粒细胞弹性蛋白酶HNE）；竞争性抑制实验测定IC50值评估选择性；SDS-PAGE凝胶电泳检测复杂蛋白质组中的选择性标记；流式细胞术和高内涵分析系统荧光成像评估细胞摄取；分子对接研究（共价和非共价）探究选择性结构基础。研究中使用了HEK293细胞裂解物、A431细胞裂解物、U937细胞和人中性粒细胞等样本。
研究结果方面，在"设计与化学"部分，研究人员基于机制性酶抑制设计单环β-内酰胺qABPs，β-内酰胺环作为反应部分负责催化丝氨酸残基的酰化，酚基引入以在酶酰化后实现碎裂过程。报道了两种类型的qABPs：I型探针将淬灭基团作为N-1酰氧甲基部分的一部分，II型探针将淬灭基团置于四元环的C-4位。两种情况下，β-内酰胺环与催化丝氨酸残基（Ser195）反应开环后可促进1,2-消除释放淬灭基团并形成可与活性位点附近第二氨基酸残基反应的电亲核体，导致不可逆抑制机制。qABPs掺入BODIPY-FL荧光团和二硝基苯部分或cAB40作为淬灭剂。通过Barbier型反应、羟甲基化、淬灭剂偶联、脱保护及点击反应合成I型qABPs；通过取代反应、尿素形成、脱保护和点击反应合成II型qABPs。在"光物理性质与酶激活"部分，所有qABPs在PBS（pH 7.4）中稳定达48小时。I型探针10和11仅在pH 12水解，12在pH 10水解；II型探针在pH 10显示紫外光谱位移，与β-内酰胺开环和淬灭基团释放一致。I型qABPs荧光增加持续达12小时，II型qABPs在2小时内实现可比荧光增加，表明II型淬灭基团释放更快更有效。用PPE评估酶激活，II型qABPs荧光在3小时内增加达6倍，I型仅5小时后观察到小幅增强。荧光量子产率测定显示大多数探针ΦF低于11%，表明有效淬灭；探针11和21例外（高于20%），可能与二硝基苯部分的酰胺键降低淬灭效率有关。激活后ΦF增加至92%，验证了提出的turn-on机制。用纯HNE和人中性粒细胞裂解物验证探针22，两种情况下均观察到荧光信号增加，缓冲液中探针荧光保持低且稳定。跳跃稀释实验表明qABPs为不可逆抑制剂。在"目标选择性"部分，对HNE和其他丝氨酸蛋白酶（胰凝乳蛋白酶、凝血酶、激肽释放酶和尿激酶）进行酶学实验。所有探针对HNE显示强抑制活性，IC50值低于0.5 μM。I型qABPs 10和12的IC50分别为0.50和0.12 μM，但由于淬灭基团释放较慢和荧光响应延迟，后续生物学评估仅聚焦于II型qABPs。II型qABPs对HNE显示高选择性，对测试面板中相关丝氨酸蛋白酶IC50值超过10 μM。SDS-PAGE实验显示，与纯化HNE孵育时仅II型探针观察到荧光；用ONO-6818预孵育消除了荧光信号，表明探针竞争HNE活性位点结合。HEK293和A431细胞裂解物加标HNE后，II型探针选择性检测HNE，探针22灵敏度分析显示线性响应（HEK293 R2=0.971，A431 R2=0.948），检测限分别为30.7 nM和7.4 nM。探针22能在人中性粒细胞和U937细胞裂解物中识别内源性HNE而无需过表达。流式细胞术显示经22处理的U937细胞荧光强度显著增加，表明有效探针内化和激活；荧光成像显示人中性粒细胞经22孵育后细胞质中观察到强荧光信号，确认有效细胞摄取。分子对接显示探针22的C-3位羟乙基取代基占据主要结合S1口袋，羟基与Val216形成氢键；共价对接表明探针22在HNE的S1口袋中建立多重相互作用，主要涉及Phe41、Phe192、Gly193、Ser214、Phe215、Val216和Arg217残基，酶表面还观察到与Leu35、Leu167、Ser214（S1）和Val216（S3）的额外相互作用。
讨论部分总结了研究所开发的qABPs具有高淬灭效率（ΦF值低于20%），激活后增加至92%；探针激活通过纯化HNE和人中性粒细胞裂解物的荧光实验确认；探针对HNE显示显著选择性，即使与密切相关的丝氨酸水解酶相比也是如此；在三种不同细胞系中（含和不含HNE加标）以及人中性粒细胞裂解物中进一步证明了在生物基质中的有效检测和激活。研究结论部分翻译如下：在本工作中，研究人员描述了生成能够在生物介质和复杂蛋白质组中选择性靶向HNE而无需肽链接头进行分子识别的qABPs的合成策略。所开发的qABPs表现出高淬灭效率，ΦF值低于20%，激活后增加至92%。通过使用纯化HNE和人中性粒细胞裂解物的荧光实验确认了探针激活。探针对HNE表现出显著选择性，即使与密切相关的丝氨酸水解酶相比也是如此。在三种不同细胞系中（含和不含HNE加标）进一步证明了在生物基质中的有效检测和激活，包括人中性粒细胞裂解物。总体而言，本研究提供了一组多功能化学工具用于研究HNE在肿瘤微环境中的作用，并支持其作为癌症治疗相关靶点的验证。
