《Sustainable Food Technology》：Waste-to-nanomedicine: scalable production of apple pomace nanovesicle-enriched fractions as nanocarriers for hydrophobic bioactives at the intestinal epithelial interfaceOpen Access
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植物来源细胞外囊泡（EVs）因其生物相容性和膜仿生特性，正成为稳定化和递送疏水性生物活性化合物的有前景的纳米载体。本研究从干燥苹果压榨残渣（一种农业食品副产物）中分离得到纳米囊泡富集级分。所得EV富集级分呈现异质性粒径分布（100–500 nm），透射电子显微
植物来源细胞外囊泡（EVs）因其生物相容性和膜仿生特性，正成为稳定化和递送疏水性生物活性化合物的有前景的纳米载体。本研究从干燥苹果压榨残渣（一种农业食品副产物）中分离得到纳米囊泡富集级分。所得EV富集级分呈现异质性粒径分布（100–500 nm），透射电子显微镜（TEM）显示其特征性囊泡形态，衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）和小角X射线散射（SAXS）证实其具有带吸附蛋白冠的脂质双层结构。此外，蛋白质组学分析鉴定出588种非冗余蛋白质，主要与代谢通路、膜转运和结构稳定相关。该EV富集级分在Caco-2细胞中表现出剂量依赖性抗氧化和抗酪氨酸酶活性以及细胞相容性。熊果酸（UA）作为一种水溶性差的生物活性化合物，通过超声处理成功与纳米囊泡富集级分结合。在Caco-2 Transwell?实验中，相对于游离UA，纳米囊泡结合增加了可从供体介质中回收的UA量，这与表观分散性改善相一致。然而，两种制剂在接收室的UA均低于定量下限，表明在测试条件下无可检测的跨上皮转运。在补充的Caco-2暴露实验中，游离UA的细胞结合级分呈时间依赖性增加，而与纳米囊泡富集级分共同给药的UA则显著较低。总体而言，这些发现表明苹果渣来源纳米囊泡富集级分主要作为稳定的细胞外纳米载体，使疏水性生物活性物保持可回收的分散状态，而非促进其上皮结合或跨上皮渗透。这些特性支持其在肠道上皮界面局部递送难溶性化合物的潜在用途。
研究背景方面，植物来源细胞外囊泡（EVs）因其生物相容性、膜仿生结构及容纳外源分子的能力，被视为天然纳米载体，可用于稳定和递送疏水性生物活性化合物。熊果酸（UA）是一种五环三萜类化合物，具有抗炎和抗氧化等生物活性，但其水溶性极低、肠道渗透性有限，口服生物利用度差，因此适合作为评价递送系统的模型货物。与此同时，植物来源EVs的临床转化面临三个工艺瓶颈：一是需要丰富且易得的原料来源，农业食品加工废弃物中的EVs可解耦生产与专门种植，但相关应用有限，苹果压榨残渣是理想候选；二是分离技术缺乏可规模化、标准化且符合良好生产规范（GMP）的方案；三是EV悬浮液在储存中易聚集和货物丢失，需要与长期保存兼容的下游步骤如冷冻干燥。基于此，研究人员旨在从干燥苹果压榨残渣中分离纳米囊泡，并评价其作为生物活性物质和药物递送系统的潜力。
研究人员采用基于切向流过滤（TFF）且设计为符合GMP要求的工艺分离EV富集级分，随后冷冻干燥以保证长期稳定性，并对苹果来源纳米囊泡的蛋白质和脂质含量、粒径、理化性质及体外生物活性进行表征；通过与小窝蛋白膜的相互作用研究评估其作为递送载体的适用性；在Caco-2细胞中确认细胞相容性后，通过超声处理使苹果来源纳米囊泡与UA结合，并利用Caco-2 Transwell?模型及补充的细胞结合实验评价其改善UA分散性和调节UA与肠道上皮界面相互作用的能力。研究结论表明，纳米囊泡富集级分主要作为细胞外稳定载体，而非渗透促进剂或快速细胞递送增强剂，支持其在肠道上皮界面维持难溶性生物活性物处于分散和可回收状态的潜力。
关键技术方法方面（不超过250字）：研究人员以干燥苹果压榨残渣为原料，经复水、离心、70 μm及0.22 μm或1 μm过滤去除果胶后，采用300 kDa截留分子量的切向流过滤（TFF）系统进行浓缩和透析，并加入甘露醇（0.5% w/v）后于?80 °C冷冻并经冷冻干燥72 h，获得冻干纳米囊泡富集级分，生产使用三个独立批次的干燥苹果渣。表征采用纳米颗粒跟踪分析（NTA）、动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）、衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）和小角X射线散射（SAXS）；蛋白质组学采用LC-MS/MS结合SEQUEST HT算法检索Malus domestica数据库；UA定量采用UHPLC-Q-Exactive Plus质谱，Caco-2细胞实验采用Transwell?模型和细胞结合实验。
研究结果方面，3.1 苹果干渣纳米囊泡的分离与表征：通过TFF并冷冻干燥成功从苹果压榨残渣中分离纳米囊泡，预过滤去除果胶是必要的，否则果胶会积累在滤膜上显著降低TFF效率；进料体积1.6–4.5 L，固定固液比1 : 500，在0.079 m2膜上浓缩四倍至0.4–1.125 L，处理时间1.5–3.5 h，跨膜压力保持2–3.5 psi，2 psi下渗透通量为151–271 L h?1 m?2，表明膜性能无明显进行性恶化；TFF应视为富集而非高分辨率纯化步骤。TEM显示纳米囊泡呈圆形形态，方法A和方法B均得到100–500 nm的异质性群体，方法B的平均直径、d50和d90显著大于方法A；冻干后方法B的平均直径、d50和d90下降，而方法A冻干前后无显著差异，表明甘露醇作为冷冻保护剂有效保持了囊泡完整性并防止聚集；NTA与DLS结果一致。方法B的蛋白质和脂质含量高于方法A但差异不显著，而方法B分离的纳米囊泡数量显著更高。ATR-FTIR显示两种样品均富集脂质和蛋白质，1610 cm?1处β-折叠和转角特征提示蛋白聚集体存在，方法B具有更高的脂质含量和脂质/蛋白比；超速离心后方法A脂质浓度降幅为方法B的两倍，而方法B蛋白浓度降幅为方法A的两倍，表明超速离心对方法B蛋白去除更有效。SAXS显示两种方法制备的纳米囊泡在低q矢量处斜率约为?2.7，表明存在具有不规则表面的二维物体（完整膜囊泡）及扩散蛋白冠，无尖锐布拉格反射表明囊泡保持流体膜组织；方法B在中q范围（0.5–2 nm?1）斜率更陡，提示存在10–13 nm大小的物体；方法A的总X射线散射强度约为方法B的一半。
3.2 苹果来源纳米囊泡的体外生物学表征：仅方法B分离的纳米囊泡表现出剂量依赖性抗氧化活性，最高浓度（10 mg mL?1）下最大活性为25%；同样仅方法B表现出抗酪氨酸酶活性，最高浓度下为24.59% ± 2.589；两种EV富集级分在测试条件下均无抗弹性蛋白酶活性；这些生物活性可能受源材料影响，本研究纳米囊泡来自主要含果皮和种子的干燥苹果压榨残渣。所有测试样品在所有浓度下均具有细胞相容性，细胞代谢活性与对照组无显著差异；但在任何测试浓度下纳米囊泡均未表现出保护细胞免受H?O?诱导氧化应激的能力。
3.3 Malus domestica纳米囊泡的蛋白质组学表征：鉴定出673种蛋白质，经成对全局比对去除冗余后保留588种非冗余蛋白质；除CRA1（种子储藏蛋白，与纳米囊泡主要来自苹果果皮和种子一致）外，丰度最高的十种蛋白质主要与糖酵解和氧化磷酸戊糖途径等代谢通路相关，包括双功能烯醇化酶2（ENO2）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPC2）、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶（UGP1）、NADP依赖苹果酸酶1（NADP-ME1）、14-3-3样蛋白（GRF3）和ATP合酶（T18C6.2）；肌动蛋白（ACT7）和泛素-核糖体蛋白（RPS27AB）等结构蛋白及激酶也在最丰富蛋白之列；大部分蛋白质与氧化磷酸化相关，尤其ATP合酶和ATP酶亚基，提示纳米囊泡在能量代谢、膜融合和囊泡运输中的潜在作用；细胞骨架相关蛋白如微管蛋白和肌动蛋白及参与蛋白折叠和应激反应的伴侣蛋白和热休克蛋白富集，支持苹果来源纳米囊泡在结构完整性、稳定性和移动性中的作用；这些蛋白质可能参与决定纳米囊泡在生物界面的物理化学行为。
3.4 UA在苹果来源纳米囊泡中的装载与膜结合：选择方法B分离的纳米囊泡作为UA递送载体，保持EV脂质浓度恒定并逐步降低UA浓度以获得不同UA : EV比（1 : 1、1 : 2、1 : 5和1 : 10），4 °C超声1 h促进装载；随着UA量相对纳米囊泡减少，UA装载效率相应增加，而吸附于透析膜的活性成分量减少；由于UA亲脂性，其倾向于吸附于同样亲脂的透析膜而非集中于透析水，水相中UA浓度低于定量下限；操作 encapsulation efficiency 在UA : EV比1 : 1、1 : 2、1 : 5和1 : 10时分别为88.2%、92.4%、96.3%和94.0%，UA回收率在各比例下为90.7%–96.3%；UA与纳米囊泡富集级分的回收并不确立其 exclusive 囊内定位。装载UA后纳米囊泡粒径增大并保持形态；FTIR显示低UA浓度下2850–2990 cm?1处CH峰强度显著降低而酰胺I和酰胺II带基本不受影响，脂质/蛋白比降低1.7倍，与UA结合脂相导致脂质链部分置换或重排一致；较高UA装载下无进一步光谱变化，提示膜相关装载位点饱和。SAXS显示双相行为：低UA浓度（UA : EV比1 : 10）下前向X射线散射比空纳米囊泡增加1.5倍，表明聚集导致粒径显著增大；较高UA浓度下前向散射几乎降至未装载纳米囊泡水平，可能由装载纳米囊泡形成聚集体并最终沉淀、散射来自剩余未装载纳米囊泡所致；低q处SAXS曲线斜率从?2.7增至3.0，证实松散聚集体形成并可能提示膜表面变化；不对称流场流分离后光散射测量证实UA装载后纳米囊泡平均回转半径从70 nm增至150 nm（UA : EV比1 : 5）；这些观察支持膜介导的装载机制，即UA与纳米囊泡富集级分脂质组分强结合同时保持整体囊泡结构。与仿生膜相互作用方面，苹果来源纳米囊泡与由单一磷脂（DMPC、DOPC）或含鞘磷脂和胆固醇的混合磷脂（筏模型DMPC : SM : Chol或DOPC : SM : Chol）组成的LUVs均发生相互作用；SAXS显示苹果来源纳米囊泡不破坏仿生膜，脂质双层形状因子保持，但低q（<0.05 nm?1）及膜形状因子散射范围出现轻微变化，低q散射高于两组分之预期且斜率更陡，表明混合物中聚集被促进；膜形状因子强度降低可能由纳米囊泡与脂质体之间脂质、蛋白质或最可能为UA等组分交换导致膜X射线对比度改变；q 0.7和2.7 nm?1处极小值未受影响，表明仿生双层厚度保持完整；DMPC或DMPC : SM : Chol脂质体变化更明显，可能因DMPC磷脂流动性低于DOPC，提示UA对流动性较低脂质亲和力更高；两种筏模型混合系统中聚集减少，可能因LUV膜刚性更高、对形成紧密聚集体所需重排抵抗力更强。
3.5 纳米囊泡结合UA在肠道上皮界面的行为：采用Caco-2细胞评价游离UA和纳米囊泡结合UA在肠道上皮界面的行为；分化Caco-2单层在Transwell?系统中评估顶侧至基底侧和基底侧至顶侧跨上皮转运，两种制剂以相同名义初始UA浓度10 μg mL?1给药，因给药后未立即分析测定UA浓度，首次实验测量对应15 min；在首次采样时间，纳米囊泡结合制剂的供体介质中回收UA浓度显著高于游离UA，鉴于UA水溶性极低，此差异与纳米囊泡富集级分维持更大量UA处于可分析回收分散状态的能力一致，而游离UA可能在稀释入实验介质后快速沉淀和/或吸附；在无t = 0分析测定的情况下，这些过程的相对贡献无法确定，15 min观察到的差异不应解释为差异性上皮摄取或滞留的证据；在所有研究时间点和两个转运方向上，接收室UA均低于分析定量下限（0.015 μg mL?1），因此在测试实验条件下，游离和纳米囊泡结合UA均未显示可检测的跨上皮转运；TEER值在转运实验前后保持高于300 Ω cm2，证实单层屏障完整性得以保持。补充的Caco-2细胞结合实验进一步阐明UA在上皮界面的命运：归一化至细胞数后，游离UA的细胞结合级分呈明显时间依赖性增加，从30 min的0.1555 ± 0.0813 μg/10?细胞增至60 min的0.3490 ± 0.1490 μg/10?细胞和120 min的0.8922 ± 0.2343 μg/10?细胞；相反，给予纳米囊泡结合UA后所有研究时间点细胞结合UA均低于定量下限；此差异表明在测试条件下与纳米囊泡富集级分结合显著限制了UA与Caco-2细胞的短期结合；与纳米囊泡富集级分共同给药时，培养上清中可回收UA量显著更多，30–120 min暴露期间纳米囊泡结合UA的上清回收为8.757 ± 0.683至9.681 ± 0.356 μg/孔，而游离UA为6.283 ± 0.521至5.104 ± 0.079 μg/孔；两种制剂的PBS洗涤液中均回收UA，表明一部分化合物保持松散结合于细胞表面和/或洗涤去除的孔相关物质；总体质量平衡进一步支持两种制剂的差异行为：纳米囊泡结合UA在30、60和120 min的定量回收分别占名义给药量的100.5 ± 4.8%、101.4 ± 3.3%和113.4 ± 2.5%，绝大多数UA保留在细胞外级分，120 min回收超过100%可能反映不同级分独立定量相关的分析和样品处理变异，不应解释为UA量实际增加；相比之下，游离UA总回收较低，30、60和120 min分别对应名义剂量的72.7 ± 1.7%、77.3 ± 3.0%和77.7 ± 4.8%，游离UA回收不完全与其水溶性差一致，可能反映沉淀、吸附于实验表面或其他未回收级分，但本实验设计无法定量区分这些贡献；这些发现支持在测试条件下纳米囊泡结合主要将UA维持在细胞外可分析回收级分，同时减少其与Caco-2细胞的短期结合且未产生可检测的跨上皮转运；30–120 min暴露期间纳米囊泡结合UA有限的细胞结合不一定与先前植物来源囊泡被Caco-2细胞摄取的报道不一致，植物来源纳米囊泡的细胞内化似乎强烈依赖时间，Hossain等报道西兰花来源纳米囊泡2 h后无可检测摄取而延长暴露后摄取明显，Citrus sinensis来源EVs在分化Caco-2细胞中6 h后细胞内定位有限而24 h后内化显著增加， garlic chive来源囊泡样纳米颗粒摄取在3–16 h内逐渐增加；这些观察提示本研究相对较短的暴露窗口可能优先反映纳米囊泡富集级分的细胞外载体行为而非其与肠上皮细胞的长期相互作用；本实验设计定量细胞级分中回收的UA但不区分表面结合与内化UA，因此结果以细胞结合UA而非细胞摄取描述，同样无法就纳米囊泡本身的细胞内化得出结论。
讨论与结论部分总结：本研究成功通过基于TFF的制造工作流及冷冻干燥从干燥苹果压榨残渣中分离纳米囊泡富集级分，工艺运行稳定，支持通过可规模化膜基方法 valorize 苹果渣的可行性，但水消耗和下游干燥仍需优化；所得级分显示特征性纳米级 morphology，冻干后保持结构完整性，具有良好细胞相容性和复杂的蛋白质与脂质组成；UA与纳米囊泡富集级分高效结合，SAXS和ATR-FTIR分析揭示强UA-脂质相互作用伴随膜重排；这种结合相对于游离UA增加了细胞外UA回收，与表观分散性改善一致，但并未增强跨上皮转运，且与Caco-2细胞中UA短期细胞结合减少相关。研究结论翻译：总之，这些结果表明纳米囊泡富集级分主要作为细胞外稳定载体，而非渗透增强剂或快速细胞递送增强剂，从而支持其在肠道上皮界面维持难溶性生物活性物处于分散和可回收状态的潜力。
