《Cancer Cell International》：Refined on-tissue chemical derivatization expands MALDI-MSI capabilities for spatial metabolomics of mammalian organs and metastatic tumors using EDC and 4-APEBA
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背景：基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MSI）广泛应用于代谢组学，因其可直接从组织中获得分子分布的高分辨率空间表征。然而，由于电离效率有限且化学结构多样，小型极性代谢物的全面分析仍然困难。组织原位化学衍生化（OTCD）已成为提高此类分析物电离效率、
背景：基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MSI）广泛应用于代谢组学，因其可直接从组织中获得分子分布的高分辨率空间表征。然而，由于电离效率有限且化学结构多样，小型极性代谢物的全面分析仍然困难。组织原位化学衍生化（OTCD）已成为提高此类分析物电离效率、灵敏度和选择性的有效策略。方法：本研究建立并系统优化了一种OTCD方法，利用4-APEBA联合碳二亚胺交联剂EDC对小鼠组织中含羰基和羧基的代谢物进行空间分析。对试剂浓度、溶剂组成和喷雾参数进行了优化，以实现跨多种组织类型的可重复衍生化。结果：优化后的方案通过4-APEBA的特征性溴同位素信号，在正离子模式下实现了含羰基和羧基代谢物的可重复且可靠的检测。应用于转移性肝和肺组织展示了该方法在生物学复杂环境中的性能。在富含肿瘤的肝脏切片中观察到与组织病理学特征相关的显著代谢异质性，在仅有小转移灶的肺组织中获得了清晰的肿瘤特异性定位。肿瘤与邻近健康区域之间的代谢差异与已确立的癌症代谢通路一致，包括糖酵解重编程。结论：本研究首次优化并研究了使用EDC和4-APEBA的可靠OTCD工作流程在小鼠组织MALDI-MSI空间代谢组学应用中的样品制备条件，并实现了黑色素瘤转移灶的局部OTCD-MSI。通过利用该试剂组合，含羰基和羧基部分的分子可基于正离子模式电离中的同位素特征被可靠注释。该应用能够探究临床相关肿瘤模型中的代谢异质性，并展示了其在未来肿瘤代谢研究中的价值。
研究背景方面，空间小分子代谢物分析因其能够提供细胞过程、生物通路和疾病机制的功能性见解而日益重要。代谢物是代谢的关键中间体和终产物，参与信号传导、能量产生和生理调控。空间分辨分析技术使得研究人员能够研究体相提取方法（如液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS））无法获取的局部代谢过程和组织异质性。MALDI-MSI是空间分子分析最广泛使用的平台之一，可无标记检测多种生物分子类别。然而，小分子代谢物的鉴定仍面临重大分析挑战，包括代谢物物理化学多样性广泛、电离效率多变导致覆盖不完整、低丰度、低m/z范围的离子抑制以及高分辨率MSI中离子产率降低等问题。OTCD通过引入易电离部分或永久电荷来提高电离效率、灵敏度和分析选择性，同时化学标记增加小分子质量有助于减少基质相关离子的光谱干扰。多种衍生化试剂已被用于OTCD-MALDI-MSI，包括FMP-10、Girard's T和P试剂、2-吡啶甲胺、TMPA和AMPP等。近期，EDC与4-APEBA两步OTCD方法在植物组织、琼脂和人胎盘中展示了衍生化含羰基和羧基代谢物的广泛实用性。4-APEBA衍生化的关键优势在于引入含溴部分，由于79Br和81Br约1:1丰度产生特征性同位素双峰，从而提高非靶向代谢组学的注释置信度。然而，该工作流程及试剂此前仅在植物材料上优化，在有限样品类型上评估，且仅在单一实验室使用特定仪器成功实施，尚未在更广泛的MALDI-MSI仪器上优化，也未应用于广泛使用的哺乳动物疾病模型如小鼠癌症组织。
本研究系统优化了OTCD工作流程，用于增强健康和癌症器官异质性小鼠组织中含羰基和羧基代谢物的空间分析。研究人员评估了试剂浓度和溶剂组成对最大化代谢物覆盖和离子产率的影响，并将优化后的OTCD-MALDI-MSI方法应用于健康肾脏组织以及含转移性黑色素瘤病灶的小鼠肝脏和肺组织。这些应用展示了在肿瘤富集样品和高度异质性组织中信号强度、代谢覆盖和分析物空间定位的可重复性能，能够表征肿瘤与周围健康区域之间的代谢差异。总体而言，本工作通过提供一种在正离子模式下检测含羰基和羧基代谢物及脂肪酸的可重复工作流程，并利用特征性溴同位素信号提高注释置信度，拓展了OTCD-MALDI-MSI代谢组学的适用性。此外，衍生化引入的特征性质量偏移通过将衍生化代谢物与内源性和基质引入的背景干扰分离，进一步提高了注释置信度，从而支持在生物学和临床相关组织环境中研究代谢物水平的异质性。
关键技术方法方面，研究人员使用SunCollect喷雾器进行组织原位化学衍生化，优化了4-APEBA浓度（1 mg/mL和0.5 mg/mL）、EDC层数（6 mg/mL，4、8和12层）及溶剂组成（100% H?O和50:50 ACN:H?O）。MALDI-MSI实验在Orbitrap Q-Exactive HF质谱仪上进行，配备常压MALDI离子源，正离子模式下质量范围m/z 300–1000。数据通过LipostarMSI处理，注释通过手动 curation 和Python流程完成，利用1.998 Da差异的溴同位素峰对进行筛选，并与人类代谢组数据库（HMDB）匹配。动物模型包括野生型B6N.129S6雄性小鼠以及注射A375人黑色素瘤细胞和人黑色素瘤患者来源异种移植（PDX）M481的NXG小鼠。样本队列来源为埃森大学医院中央动物实验室饲养的小鼠及Janvier Labs购买的NXG小鼠。
研究结果方面，在溶液反应实验中，六种代谢物标准品（丙酮酸、香草醛、柠檬酸、富马酸、葡萄糖和α-酮戊二酸）与4-APEBA和EDC反应，仅丙酮酸和香草醛一致获得预期衍生化产物，羧酸衍生化仍然有限，表明EDC活化步骤可能是限速因素。在小鼠组织应用优化中，研究人员首先尝试重现现有方案并适配仪器，但发现信号强度、代谢覆盖和图像质量与文献存在显著差异，原有方案无法直接转移，需要系统重新优化。降低4-APEBA浓度至0.5 mg/mL降低了衍生物基峰强度，有助于分析相对强度，且未显著降低注释数量或灵敏度。增加EDC层数至8层（6 mg/mL）改善了信号强度和覆盖，进一步增加未带来额外改善。溶剂组成方面，50:50 ACN:H?O在喷雾和图像质量方面表现最佳，产生细腻均匀的喷雾结果并阻止水溶性代谢物离域。优化参数下三份肾脏连续切片的可重复性评估显示目标代谢物分布模式高度相似，所选代谢物变异系数（CV）低于35%。代谢覆盖评估通过手动 curation 和Python自动化流程联合完成，在肾脏重复样本中获得46个注释（92个信号峰），涵盖9个化合物类别和16个亚类，涉及32条不同通路，其中精氨酸生物合成、TCA循环和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路覆盖最完整。与DHB相比，OTCD将目标代谢物检测从2个扩展至46个；与NEDC相比，46个注释中有27个为OTCD独有检测。在干燥液滴标准品确认中，所有点样标准品均检测到预期衍生化产物，TCA循环多数代谢物得到确认。柠檬酸产生与乌头酸衍生化质量对应的强碎片信号，可能通过气相脱水产生。衍生化产物稳定性评估显示12种标准品中8种CV低于35%。表面反应产率使用氘代肌酸（d3-creatine）估算约为98%。在转移性组织应用中，PDX黑色素瘤肝转移样本中一致注释超过70种化合物，肿瘤区域 creatine、天冬氨酸和泛酸相对信号强度较高，而己糖相对降低，与糖酵解重编程标志一致。肺转移模型中获得超过75种化合物的注释，肿瘤区域TCA循环代谢物如柠檬酸和苹果酸相对信号强度增加，己糖降低。两种模型中未监督分割与病理学家注释的H&E肿瘤区域空间一致性良好，肝脏DICE系数为0.84，肺为0.82。
讨论部分总结了OTCD workflow在探索性代谢组学中的附加价值，包括同位素确认和单一极性下覆盖增加。研究人员指出溶液反应中羧酸衍生化失败可能归因于EDC活化步骤的pH依赖性水解，但由于pH调整无法直接转化至组织原位衍生化，该机制仍为假设。优化中降低衍生化试剂浓度减少了基峰强度和Orbitrap离子积累，从而最小化离子抑制和分析器过饱和，同时不牺牲代谢物覆盖或灵敏度。溶剂组成对代谢物检测具有分析物特异性效应，50:50 ACN:H?O在分析灵敏度和覆盖方面表现有利，ACN的加入支持蒸发过程产生更细腻均匀的喷雾，且高含水量促进EDC水解从而有效降低羧酸衍生化产率，部分替换水为乙腈可最小化该趋势。注释流程基于理论精确质量并过滤化学合理性，无法区分异构体或同分异构体，所有注释均为推定性的。OTCD能够同时检测通常在负离子模式下测量的极性代谢物和通常在正离子模式下测量的脂肪酸，通过连接永久正电荷在单一极性下实现，这对于样品量有限的临床前和临床模型具有关键优势。TCA循环代谢物通过产生可预测的质量偏移和溴同位素双峰降低了错误鉴定可能性。在肝转移模型中检测到多种癌症相关代谢物，与当前文献一致；泛酸的高强度信号可能提示能量相关代谢物积累以支持替代能量途径。肺转移模型中观察到的代谢改变与肝转移模型一致，提示中心碳代谢转变和能量产生增强以支持肿瘤生长。研究还检测到4-羟基壬烯醛等醛类，扩展了单次测量中可检测的代谢物种类范围。可靠检测具有临床关联的代谢物如羟基丁酸和酮丁酸展示了OTCD实现生物学相关代谢物空间分析的能力。研究人员指出相对信号强度的变化不一定反映组织区域间代谢物浓度的变化，也可能源于基质效应和局部离子抑制差异，未来整合OTCD与稳定同位素示踪策略或定量MSI可实现对完整转移灶内代谢通量的直接测量。两种应用模型均基于黑色素瘤疾病，但一者来自永生化细胞模型，一者来自PDX细胞模型，讨论仅基于空间代谢物检测及其信号强度。综上，这些结果证明OTCD空间代谢组学支持在明确界定的转移组织以及肿瘤累及有限的更具挑战性样本中获得具有生物学意义的见解。空间模式在重复样本间高度可重复并与H&E组织病理学密切对应，确认在研究像素尺寸（20–25 μm）下未观察到代谢物显著空间离域。虽然由于源内碎裂或异构体可能的干扰，代谢物归属仍为推定性，但研究结果表明OTCD有效捕获了检测疾病相关代谢改变的能力。
研究结论部分翻译：总体而言，组织原位化学衍生化是克服空间代谢组学当前限制的有前景策略，特别是MALDI-MSI中较小样品量下内源性代谢物的注释置信度和覆盖度限制。本研究系统优化并展示了使用EDC和4-APEBA的OTCD工作流程，以改善多种小鼠组织类型中含羧基和羰基代谢物的检测。实验参数优化实现了可重复的离子信号和由衍生化产物诊断性溴同位素模式促进的高置信度代谢物注释。应用于两种转移组织模型时，该方法揭示了肿瘤与周围组织微环境之间空间上不同的代谢特征，包括与能量代谢重编程一致的改变。值得注意的是，在大型转移区域和较小结构复杂的病灶中均实现了清晰的代谢对比，展示了该方法的广泛适用性。由于潜在源内碎裂和光谱重叠导致的明确注释方面的剩余限制，可能通过衍生化策略、仪器性能和分析软件的未来进展来解决。尽管如此，当前结果为复杂组织样品的稳健空间代谢组学表征建立了坚实基础。总之，本工作证明了OTCD在小鼠癌症模型中的适用性和可靠性，并突出了其在健康和疾病中揭示代谢异质性的潜力，为空间代谢组学研究在癌症研究中的扩展应用铺平了道路。
