ARV1甾醇结合蛋白小分子抑制剂VB-84133阻断脂质结合并模拟ARV1功能缺失表型

《Journal of Biological Chemistry》：A small molecule inhibitor of human ARV1 sterol-binding protein blocks lipid binding

　　

ARV1（are2 required for viability 1）甾醇结合蛋白在真核物种间保守，可结合胆固醇、磷脂及磷酸肌醇。人hARV1突变与癫痫性脑病相关；mArv1缺陷小鼠对饮食诱导的肥胖具有抵抗性；Scarv1Δ细胞在糖基磷脂酰肌醇（GPI）生物合成、甾醇分布及鞘脂生物合成方面存在缺陷；人细胞中敲低ARV1导致内质网胆固醇蓄积。ARV1如何调控脂质运输尚不清楚。开发靶向ARV1脂质结合能力的抑制剂将为理解其功能提供重要线索。研究人员采用均相时间分辨荧光（HTRF）高通量筛选方法，鉴定出VB-84133为人ARV1脂质结合抑制剂，其IC50为3.2 ± 0.21 μM。在脂质体结合实验中，VB-84133阻断ARV1同源结构域（AHD）与胆固醇、磷脂酰丝氨酸及其他磷脂的相互作用。该抑制对ARV1相互作用具有特异性，因为VB-84133并不阻断磷脂酰丝氨酸与Annexin A2或A5的结合。研究人员利用体外荧光脂质体淬灭实验证明ARV1可在内、外膜之间转运磷脂酰丝氨酸，且该转运被VB-84133抑制。在表型研究中，酿酒酵母（S. cerevisiae）ARV1细胞在VB-84133存在下发生arv1相关细胞死亡。VB-84133在HepG2细胞中组成性激活未折叠蛋白反应（UPR）及XBP1剪接，但与ARV1基因表达缺失并不协同进一步促进剪接。VB-84133亦抑制NBD-胆固醇向脂滴的定位。总体而言，VB-84133特异性靶向ARV1，其依据在于该化合物能够结合ARV1并触发与ARV1缺陷相关的功能缺失事件。

ARV1（are2 required for viability 1）甾醇结合蛋白在真核物种中高度保守，可结合胆固醇、磷脂与磷酸肌醇。人ARV1遗传变异与癫痫性脑病及认知缺陷相关，患者来源细胞存在GPI（糖基磷脂酰肌醇）合成受损；敲低人肝癌HepG2细胞中的ARV1导致内质网（ER）胆固醇蓄积并激活UPR（未折叠蛋白反应），提示ARV1参与甾醇由ER向质膜的转运及细胞应激调控。小鼠Arv1缺失可抵抗饮食诱导的肥胖、改善糖耐量与胰岛素敏感性、降低肝脏甘油三酯并减轻脂肪肝。酵母Scarv1Δ细胞表现多效性脂质表型、组成性UPR激活及对脂肪酸补充的敏感性增强。然而，ARV1的具体生化功能尚未明确，其预测结构与已知脂质转运蛋白（LTP）无同源性，且缺乏靶向该蛋白脂质结合活性的工具分子。为此，研究人员以含AHD（Arv1同源结构域）的N端98个氨基酸重组蛋白（HIS-N98）为靶标，开展高通量筛选以获得抑制剂，进而从生化、脂质体、酵母及人细胞多层面验证其作用机制与表型效应。

主要关键技术方法包括：采用HTRF（均相时间分辨荧光）高通量筛选对约550万化合物进行评价；利用大肠杆菌表达并纯化6×HIS标签N端98氨基酸蛋白（HIS-N98）及Annexin A2/A5；开展蛋白-脂质体共沉淀与免疫印迹分析；建立基于二硫苏糖醇（dithionite）淬灭NBD-PS（NBD标记磷脂酰丝氨酸）的荧光脂质体转运实验；采用酿酒酵母（S. cerevisiae）点样生长实验与HAC1剪接分析；在HepG2细胞中进行ARV1 siRNA敲低、ELISA检测pIRE1与XBP1s、XBP1u-GFP报告基因 foci 计数、qRT-PCR及NBD-胆固醇摄取与定位观察。

研究结果如下。VB-84133是人ARV1脂质结合活性的强效抑制剂：HTRF筛选鉴定VB-84133抑制HIS-N98与生物素化磷脂酰甘油（Bio-PG）结合，IC₅₀为3.2 ± 0.21 μM，并抑制与Bio-PA、Bio-PS、Bio-CL的结合（IC₅₀分别为4.6 ± 0.62、5.1 ± 0.34、8.8 ± 1.2 μM），显示其为广谱脂质-ARV1相互作用抑制剂。VB-84133对HIS-N98具选择性而不抑制Annexin-脂质结合：HIS-N98、Annexin A2与A5均强结合Bio-PS，但VB-84133不能抑制磷脂酰丝氨酸与A2或A5的结合。VB-84133抑制HIS-N98与胆固醇及磷脂脂质体结合：共沉淀实验显示HIS-N98与PC:Chol、PC:PG结合而不与单纯PC结合，VB-84133剂量依赖性减少沉淀中HIS-N98，对PC:Chol、PC:PG、PC:PS、PC:PA、PC:CL的IC₅₀分别为1.4 ± 0.31、0.33 ± 0.54、0.11 ± 0.25、0.31 ± 0.4、2.5 ± 0.75 μM，其效力显著高于乱序酶（scramblase）抑制剂1PBC与R5421。ARV1可将磷脂酰丝氨酸由脂质体内膜转运至外膜：HIS-N98使NBD-PS淬灭值由48% ± 0.13%降至12% ± 0.62%，VB-84133剂量依赖性逆转该效应，IC₅₀为9.7 ± 1.4 μM。VB-84133处理使酿酒酵母呈现Scarv1Δ表型：表达ScARV1或hARV1的Scarv1Δ细胞在缬氨霉素或尼日利亚霉素（nigericin）平板上于VB-84133存在时几乎完全丧失活力，在油酸平板上同样不能生长，并在无衣霉素时出现HAC1剪接。VB-84133在HepG2细胞中激活UPR、模拟ARV1功能缺失：VB-84133、ARV1敲低及衣霉素均升高pIRE1/IRE1比值与XBP1s水平，而敲低与药物联合不产生叠加效应。ARV1功能降低改变UPR依赖性脂肪生成基因表达：XBP1u-GFP报告显示衣霉素、ARV1敲低、VB-84133分别使GFP foci 增加约10、21、30倍，联合处理与单用药物无差异；ACC2、FASN、SCD1表达在敲低或药物处理后升高，联合无进一步上调。VB-84133抑制NBD-胆固醇向脂滴定位：ARV1敲低与VB-84133处理均降低含5个以上NBD-胆固醇阳性脂滴的细胞比例，二者间无统计学差异。

讨论部分指出，ARV1缺陷破坏ER脂质稳态，酵母中Arv1可能翻转早期GPI中间体，结合其与3-O-磺基半乳糖基神经酰胺结合及脂滴变化，提示ARV1可能在ER-脂滴接触位点参与脂质运输。研究所用HIS-N98缺失跨膜结构域，其截短对脂质结合动力学的影响尚未解决，但结合常数低于相应脂质临界胶束浓度，提示其与单体脂质结合。ARV1序列与已知LTP无同源性，却广谱结合脂质，类似SCP-2（甾醇载体蛋白-2）与部分ORP（氧化甾醇结合蛋白相关蛋白）家族成员。HTRF与脂质体实验共同表明VB-84133直接作用于ARV1；酵母与HepG2实验支持其模拟ARV1缺失，且HepG2中IRE1-XBP1分支为关键下游反应；NBD-胆固醇实验提示ARV1可能支持胆固醇由ER向脂滴转运。研究亦指出局限：NBD-胆固醇经SR-BI内化并酯化，未含NBD-胆固醇酯的脂滴可能未被检出；全长ARV1纯化仍具挑战。结论为：VB-84133是ARV1-脂质结合的强效选择性抑制剂，在蛋白相关脂质体实验中降低HIS-N98与脂质共沉淀，酵母与HepG2细胞研究进一步支持ARV1为其直接细胞靶点，该化合物为深入解析ARV1在相关疾病中的作用奠定基础。