PAK1与PAK2双基因敲除小鼠巨噬细胞虽迁移模式显著改变但趋化性得以保留

《Journal of Biological Chemistry》：Mouse macrophages lacking both Pak1 and Pak2 exhibit preserved chemotaxis despite a strikingly altered migration mode

　　

巨噬细胞通过膜突起和尾端回缩的反复循环沿趋化因子梯度定向迁移。趋化因子受体信号在 leading edge 激活 Rho GTPases Rac1、Rac2 和 Cdc42，后者通过肌动蛋白成核因子（如 Arp2/3 复合物）刺激肌动蛋白聚合。同时，这些 Rho GTPases 通过激活 p21 活化激酶（PAKs）稳定膜突起，PAKs 通过激活含 LIM 基序的激酶抑制肌动蛋白解聚因子 ADF/cofilin 家族。本研究利用髓系限制性 Pak2 条件性敲除（cKO）、Pak1/Pak2 双基因敲除（dKO）和 Pak1 基因敲除（Pak1^–/–）小鼠模型，确定 PAKs 是否为趋化导航所必需。在实时趋化性实验中，缺乏 Pak1 的巨噬细胞与对照细胞无法区分，而 Pak2 cKO 巨噬细胞频繁呈现树突状形态，并表现出轻度受损的趋化性和细胞速度。相比之下，同时缺乏 Pak1 和 Pak2 的巨噬细胞表现出强劲的趋化性和显著增加的细胞速度。引人注目的是，Pak1/Pak2 dKO 细胞采用一种独特的、趋化因子诱导的圆形形态，其特征为 leading edge 广泛的膜皱褶、富含横向肌动蛋白纤维以及紧凑的尾端，尽管这些细胞间歇性过渡为较慢的、部分铺展或延长的形态。与对照细胞相比，补体 C5a 诱导的极化 dKO 细胞中磷酸化 cofilin（Ser3）水平降低，而总 cofilin 水平不变。总之，单独缺失 Pak2 轻度损害趋化性，而 Pak1 和 Pak2 联合缺失则保留了定向导航同时增强细胞运动性，这可能通过减少对 ADF/cofilin 的抑制和增加 leading edge 的肌动蛋白周转来实现。

**研究背景与问题**：巨噬细胞沿趋化因子梯度定向迁移依赖于 leading edge 的肌动蛋白聚合与尾端回缩的协调循环。经典树突状成核模型认为，Rho GTPases Rac1、Rac2 和 Cdc42 在 leading edge 激活 Arp2/3 复合物促进肌动蛋白分支聚合，同时通过 p21 活化激酶（PAKs）激活 LIM 基序激酶（LIMK1/LIMK2），后者磷酸化并抑制 ADF/cofilin 家族（肌动蛋白解聚因子），从而稳定新合成的肌动蛋白丝和持续性板状伪足突起。然而，PAK1 和 PAK2 在巨噬细胞趋化性和定向导航中的相对贡献及功能冗余程度尚不清楚。既往研究多依赖 siRNA 敲低、显性负性肽或药理学抑制剂，存在脱靶效应和实验体系差异等问题，且 PAK2 全身敲除具有胚胎致死性，限制了遗传学模型的建立。因此，研究人员利用髓系限制性条件性敲除小鼠模型结合实时趋化性实验，旨在明确 PAKs 是否为巨噬细胞运动和趋化导航所必需。

**研究内容与结论**：研究人员采用髓系限制性 Pak2 cKO、Pak1/Pak2 dKO 和 Pak1^–/– 小鼠模型，结合实时趋化性实验、活细胞共聚焦显微镜、STED 超分辨显微镜和免疫印迹等技术，系统表征了 PAK 缺陷巨噬细胞的形态、运动性、趋化性、膜动力学、肌动蛋白组织和 cofilin 信号变化。结论表明，单独缺失 Pak2 轻度损害趋化性和细胞速度；单独缺失 Pak1 对趋化性、速度和形态均无显著影响；而 Pak1/Pak2 联合缺失虽保留强劲的定向趋化性，但细胞速度显著增加，迁移模式发生显著改变——细胞采用以 leading edge 广泛膜皱褶和紧凑尾端为特征的圆形形态。磷酸化 cofilin（Ser3）水平在 C5a 诱导的极化 dKO 细胞中降低，而总 cofilin 水平不变。该研究的重要意义在于揭示了 PAK1/PAK2 信号并非巨噬细胞趋化导航所必需，而是迁移模式的重要调控因子，挑战了经典树突状成核模型中 PAK–LIMK–ADF/cofilin 轴为趋化性核心机制的观点。

**关键技术方法**：研究人员主要采用以下技术方法：（1）髓系限制性 Pak2 cKO（Pak2^fl/fl/LysM-Cre）、Pak1/Pak2 dKO（Pak1^–/–/Pak2^fl/fl/LysM-Cre）和 Pak1^–/– 小鼠模型，以 Pak2^fl/fl 和 C57BL/6 野生型（WT）小鼠为对照，分离 resident mouse peritoneal macrophages（驻留小鼠腹腔巨噬细胞）；（2）实时二维趋化性实验（μ-Slide chemotaxis chamber），以重组小鼠补体 C5a（20 nM）为趋化因子，延时相差显微镜每 2 分钟采集图像持续 14 小时，分析 6–12 小时迁移轨迹；（3）活细胞延时共聚焦激光扫描显微镜监测板状伪足膜动力学，结合 kymography 分析突起–回缩事件；（4）免疫荧光结合 STED 超分辨显微镜观察 F-actin 组织架构；（5）免疫印迹检测 PAK1、PAK2、PAK4 和总 cofilin 蛋白表达水平；（6）RNA-seq 和 data-independent acquisition mass spectrometry（DIA-MS）检测 PAK 家族成员表达谱。

**研究结果**：

**Resident mouse peritoneal macrophages express mRNA for Pak1 and Pak2, but not Pak3–Pak6**：通过 RNA-seq 分析分选纯化的 F4/80⁺ 驻留小鼠腹腔巨噬细胞，发现仅 Pak1 和 Pak2 表达，Pak3–Pak6 不表达；同时表达下游靶点 Limk1、Limk2、Tesk1 以及 ADF/cofilin 家族成员和 slingshot 磷酸酶（Ssh1–Ssh3）。

**Resident mouse peritoneal macrophages express the proteins PAK1 and PAK2**：DIA-MS 检测到 PAK2 信号，PAK1 未检出（可能反映 DIA-MS 灵敏度限制）；免疫印迹证实对照（Pak2^fl/fl）巨噬细胞表达 PAK1 和 PAK2 蛋白，而 Pak1/Pak2 dKO 细胞中两者均缺失；PAK4 在巨噬细胞中可忽略或不可检测，DIA-MS 中 PAK4 信号经肽段序列分析归因于非唯一肽段的模糊分配。

**Macrophages isolated from Pak1/Pak2 dKO mice exhibit robust chemotaxis and markedly increased cell velocity**：实时趋化性实验显示，与对照（Pak2^fl/fl）相比，Pak2 cKO 巨噬细胞速度和趋化效率（y-FMI）轻度降低；而 Pak1/Pak2 dKO 巨噬细胞速度显著增加，同时维持强劲趋化性。

**Pak1/Pak2 dKO macrophages migrating in a complement C5a gradient exhibit a compact morphology with extensive ruffling**：延时相差显微镜显示，对照细胞典型表现为紧凑尾端和板状伪足突出前端；Pak2 cKO 细胞更频繁采用树突状形态；Pak1/Pak2 dKO 细胞则缺乏明显板状伪足，呈现紧凑圆形形态伴显著外周膜皱褶，间歇性过渡为延长或树突状形态。形态分类统计显示 dKO 细胞以紧凑圆形为主，而"紧凑尾端伴突出前端"形态几乎不出现。

**Uniform application of complement C5a induces lamellipodial protrusions in Pak2fl/fl and Pak2 cKO macrophages but extensive peripheral membrane ruffling in Pak1/Pak2 dKO cells**：活细胞共聚焦显微镜显示，均匀施加 C5a 诱导对照和 Pak2 cKO 细胞板状伪足突起，而 dKO 细胞呈现圆形形态伴广泛外周膜皱褶和紧凑尾端伴多根回缩纤维；dKO 细胞面积变化显著小于对照和 Pak2 cKO 细胞。

**Pak1/Pak2 dKO macrophages exhibit enhanced membrane protrusion–retraction dynamics following complement C5a stimulation**：Kymography 分析表明，C5a 刺激后 6 分钟内 dKO 巨噬细胞 leading edge 突起–回缩事件频率显著高于对照细胞。

**Pak1/Pak2 dKO macrophages exhibit a distinct F-actin architecture following complement C5a-induced polarization**：STED 成像显示 dKO 细胞广泛皱褶的 leading edge 内富含横向肌动蛋白纤维，且缺乏锥形尾端，代之以宽大线状尾缘，回缩纤维由此延伸。

**Pak1/Pak2 dKO macrophages exhibit reduced phospho-cofilin (Ser3) levels following complement C5a-induced polarization**：定量免疫荧光显示 dKO 巨噬细胞磷酸化 cofilin（Ser3）荧光强度显著低于对照，而免疫印迹证实总 cofilin 蛋白水平不变。λ-磷酸酶处理显著降低磷酸化 cofilin（Ser3）免疫荧光信号，验证了该信号对磷酸化状态的依赖性。

**Pak1 deficiency alone does not explain the Pak1/Pak2 dKO phenotype**：Pak1^–/– 巨噬细胞在形态、速度和趋化效率上与 WT 无显著差异；C5a 诱导的细胞铺展在 WT 和 Pak1^–/– 之间也无显著差异，排除 Pak1 单独缺失对 dKO 表型的贡献。

**讨论与结论**：研究人员讨论指出，PAK1/PAK2 联合缺失未损害趋化性这一发现与经典树突状成核模型的预期相悖，可能与既往研究采用的 siRNA 敲低、显性负性肽或药理学抑制等方法存在脱靶效应有关。dKO 细胞中磷酸化 cofilin（Ser3）降低直接支持 PAK–LIMK–ADF/cofilin 通路被破坏，导致肌动蛋白丝切断和周转增加，从而解释广泛膜皱褶、增强的突起–回缩动力学和增加的速度。此外，PAK 相互作用的 RhoGEFs αPIX/βPIX 正反馈环的破坏可能降低 Rac/Cdc42 信号的空间限制，导致 dKO 细胞宽大 leading edge 的形成。研究人员也指出本研究局限于二维实验条件，三维环境和不同基质刚度下的表现有待进一步确定；PAK 的其他下游靶点（如 paxillin）和 TESK1 对 ADF/cofilin 的替代性磷酸化调控也可能贡献于观察到的表型。研究结论翻译如下：总之，研究人员的发现表明，在所检测的实验条件下，PAK1 和 PAK2 信号并非补体 C5a 定向巨噬细胞趋化性所必需，而是巨噬细胞迁移模式的重要调控因子。