肝窦内皮细胞中BMP2与BMP6前结构域对异源二聚体生成的必要性及其在切割分泌后与配体的结合

《Journal of Biological Chemistry》：BMP2 and BMP6 prodomains are essential to generate heterodimers in liver endothelial cells and associate with ligands after cleavage and secretion

　　

专业摘要翻译 肝窦内皮细胞（LEC）来源的骨形态发生蛋白（BMP）2和BMP6协同调节肝细胞铁调素（hepcidin）的产生，从而控制全身铁稳态，但其机制尚不明确。BMP是以同源二聚体或异源二聚体形式存在的蛋白质，其作为前体产生，包含一个非信号传导的前结构域和一个经蛋白酶水解切割后释放的活性配体。尽管前结构域不参与信号传导，但它们在配体生成和活性中发挥多效性作用。本研究利用LEC和肝细胞来源的细胞培养体系，探究BMP2和BMP6前结构域及蛋白酶水解切割如何影响同源二聚体形成、异源二聚体形成以及hepcidin调控。研究人员发现，当BMP2和BMP6在LEC中共表达时，它们会形成异源二聚体，该异源二聚体诱导hepcidin的能力强于同源二聚体。BMP2前体在两个弗林蛋白酶（furin）保守位点的蛋白酶水解切割是生成完全活性的BMP2/6异源二聚体所必需的，尽管在任一位点切割均可生成部分活性的异源二聚体。不可切割的BMP6前体无法生成完全活性的BMP2/6异源二聚体，并对BMP2同源二聚体的形成产生显性负效应。研究人员还证明，在LEC中，同源的BMP2和BMP6前结构域对于同源二聚体和异源二聚体的形成至关重要。最后，两个前结构域在切割和分泌后仍与BMP2/6异源二聚体保持非共价结合。BMP6前结构域也与BMP6同源二聚体保持结合，而BMP2前结构域与BMP2同源二聚体的结合则受到切割位点之间连接区的影响。研究人员的发现表明，BMP2/6异源二聚体很可能是调节hepcidin和铁稳态的主要内源性配体，并且BMP2和BMP6前结构域对于在LEC中功能性BMP2/6的形成均至关重要。

论文解读文章

研究背景与研究问题

骨形态发生蛋白（BMP）2和BMP6属于转化生长因子-β（TGF-β）配体超家族，在发育和成体组织稳态中发挥重要作用。BMP2对胚胎发生至关重要，而BMP6的核心非冗余功能是与BMP2协同调节全身铁稳态，具体方式是通过控制肝脏铁调素（hepcidin）激素的表达。肝窦内皮细胞（LEC）分泌的BMP6和BMP2与邻近肝细胞上的共受体血幼素（hemojuvelin）及BMP受体复合物结合，诱导SMAD1/5/9磷酸化，进而激活hepcidin转录。该通路中多个关键蛋白的突变会导致遗传性血色病。值得注意的是，小鼠遗传学数据表明，同时缺失内皮BMP2和BMP6的小鼠与单独缺失任一基因的小鼠具有相同的血色病表型，这提示BMP2和BMP6必须协同工作，但其协作机制此前未被明确阐明。BMP以前体蛋白形式生成，经弗林蛋白酶（furin）切割后释放活性配体二聚体，可形成同源二聚体或由不同配体构成的异源二聚体。前结构域虽无信号活性，但在配体折叠、二聚化、细胞内运输及生物利用度中起关键作用。已有研究发现BMP2前体在两个furin保守位点被顺序切割，而BMP6仅有一个切割位点。此外，在不同细胞环境中，BMP2和BMP6同源二聚体的生成效率存在差异，提示前结构域可能具有细胞环境特异性的功能角色。然而，BMP2和BMP6前结构域如何在LEC中促进功能性配体生成的机制尚不清楚，且两者是否能形成功能增强的异源二聚体也缺乏确凿证据。

研究目的与结论

本研究旨在通过细胞培养和免疫共沉淀实验，明确BMP2和BMP6在LEC中共表达时是否形成异源二聚体，并探讨蛋白水解切割和前结构域对功能性BMP2/6异源二聚体及同源二聚体形成的影响，以及前结构域在切割分泌后是否仍与配体保持关联。研究得出结论：BMP2和BMP6在LEC中共表达时确实形成异源二聚体，且其诱导hepcidin的效力显著高于同源二聚体；BMP2的两个furin切割位点（S1和S2）均需被切割才能生成完全活性的BMP2/6异源二聚体；BMP6的切割对其自身及异源二聚体功能至关重要，不可切割的BMP6突变体对BMP2活性具有显性负效应；同源的BMP2和BMP6前结构域是生成完全活性同源二聚体和异源二聚体的必要条件；切割后，BMP2和BMP6前结构域均与BMP2/6异源二聚体保持非共价结合，而BMP2前结构域与其同源二聚体的结合受S1-S2连接区影响。这些发现揭示了BMP2/6异源二聚体很可能是体内调节hepcidin和铁稳态的主要内源性配体。

关键技术方法

1. 1.
   细胞模型与共表达系统：使用永生化人LEC系TMNK1细胞和人胚肾HEK293细胞作为配体生产细胞，以人肝癌衍生Hep3B细胞作为肝细胞模型评估信号活性。通过共转染带有不同表位标签（如Myc、Flag、HA、Ollas、V5）的BMP2和BMP6前体编码cDNA，模拟体内共表达场景。
2. 2.
   免疫印迹与二聚体检测：利用还原和非还原条件下的免疫印迹（Immunoblotting）分析条件培养基中的配体单体与二聚体形式，通过分子量迁移差异区分同源二聚体和异源二聚体。
3. 3.
   免疫共沉淀（Co-IP）：利用不同表位标签进行双向免疫共沉淀，从条件培养基中捕获特定配体，并通过检测共沉淀的配体或前结构域，确证异源二聚体的形成以及前结构域与配体的非共价结合。
4. 4.
   功能活性评估：将含不同配体的条件培养基处理Hep3B细胞，通过免疫印迹检测SMAD1/5/9磷酸化（pSMAD1/5/9）水平，并结合定量实时PCR（qRT-PCR）检测hepcidin编码基因HAMP的mRNA表达，以量化配体的信号传导效能。

研究结果

BMP2和BMP6在LEC和HEK293细胞中形成信号效率更高的异源二聚体

通过在TMNK1 LEC和HEK293细胞中共表达带不同标签的BMP2和BMP6前体，研究人员在非还原免疫印迹中观察到一种新的、迁移位置符合完全切割BMP2/6异源二聚体预测大小的配体条带，且该条带在单转细胞培养基混合样品中不出现。通过免疫共沉淀，研究人员在抗BMP2抗体捕获的组分中检测到BMP6配体，确证了异源二聚体的形成。功能实验显示，来自共表达细胞的培养基诱导Hep3B细胞产生pSMAD1/5/9和HAMP mRNA的水平显著高于单转细胞或其混合物，表明异源二聚体具有更强的信号活性。

LEC中BMP2/6异源二聚体的完全激活需要BMP2和BMP6前体的切割

利用BMP2的S1或S2切割位点突变体（S1G和S2G）与野生型BMP6共表达，发现这些突变体仍能与BMP6形成异源二聚体，并表现出比各自同源二聚体更强的信号活性，但其诱导pSMAD1/5/9和HAMP的能力显著低于野生型BMP2/6异源二聚体，表明两个位点的完全切割是获得最大活性的必要条件。利用BMP6的切割位点突变体（R-G）与野生型BMP2共表达，结果显示该突变体不仅无法形成活性异源二聚体，还阻止了BMP2同源二聚体的分泌，并几乎完全消除了信号活性，说明BMP6切割对异源二聚体功能不可或缺，且未切割的BMP6具有显性负效应。

同源前结构域是LEC中生成完全活性同源二聚体和BMP2/6异源二聚体所必需的

通过构建前结构域交换的嵌合体（BMP2-6：BMP2前结构域融合BMP6配体；BMP6-2：BMP6前结构域融合BMP2配体）进行实验。单独表达BMP2-6时，BMP6同源二聚体分泌量和信号活性远低于野生型BMP6；其与野生型BMP2共表达形成的异源二聚体活性也弱于野生型BMP2/6组合。单独表达BMP6-2时，完全检测不到BMP2配体分泌和信号活性；其与野生型BMP6共表达产生的异源二聚体活性也显著低于野生型组合。这表明，在TMNK1 LEC中，各自的同源前结构域对于高效生成和分泌活性BMP2同源二聚体、BMP6同源二聚体及BMP2/6异源二聚体是必需的。

切割和分泌后，BMP6前结构域与BMP6同源二聚体保持非共价结合，而S1-S2连接区影响BMP2前结构域与其同源二聚体的结合

免疫共沉淀实验显示，从条件培养基中捕获BMP6配体后，可以检测到共沉淀的BMP6前结构域，表明两者在切割分泌后仍牢固结合。相比之下，BMP2前结构域与完全切割的BMP2配体之间的共沉淀信号非常微弱，提示其结合较弱。然而，当使用保留S1-S2连接区的BMP2切割突变体（S1G或S2G）时，前结构域与配体的共沉淀信号显著增强，表明该连接区的存在有助于加强两者的非共价相互作用。

BMP2和BMP6前结构域在切割和分泌后仍与BMP2/6异源二聚体保持非共价结合

通过在HEK293细胞和TMNK1 LEC中进行双向免疫共沉淀实验（分别从抗BMP2或抗BMP6配体捕获的组分中检测对方前结构域），研究人员证实，无论是BMP2前结构域还是BMP6前结构域，均在切割和分泌后与BMP2/6异源二聚体保持非共价结合。

讨论与结论总结

本研究提供了确凿证据，证明BMP2和BMP6在LEC中共表达时形成异源二聚体，且其诱导hepcidin的能力强于同源二聚体。这一发现解释了为何在内皮Bmp2或Bmp6单敲除小鼠中，另一种配体的同源二聚体无法补偿其功能，很可能是因为异源二聚体才是主要的生理活性形式。研究阐明了蛋白水解切割和前结构域在调控BMP2/6异源二聚体形成与活性中的关键作用：BMP2的双位点顺序切割和BMP6的单一位点切割均是生成完全活性异源二聚体的前提，且未切割的BMP6突变体对BMP2具有显性负效应。此外，同源前结构域在LEC中对高效生成所有形式的活性配体至关重要，这与爪蟾胚胎中的情况不同，凸显了细胞环境特异性。最后，研究发现BMP2和BMP6前结构域在分泌后仍与异源二聚体保持非共价结合，这类似于BMP7的机制，可能参与调节配体的稳定性、细胞外基质相互作用或受体结合亲和力，从而影响下游信号强度。这些发现加深了对铁代谢调控分子机制的理解，并为血色病等铁过载疾病的发病机理提供了新的见解。