《Journal of Biological Chemistry》：Functional differences of two homologous enzymes for LacdiNAc biosynthesis: B4GALNT3 and B4GALNT4
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哺乳动物体内蛋白质可被多种糖链修饰，从而赋予其广泛的功能多样性。LacdiNAc（LDN，GalNAcβ1-4GlcNAc）是一种存在于N-糖链和O-GalNAc糖链中的独特二糖，可调节循环中糖蛋白的稳定性并抑制N-糖链的末端修饰。尽管已知两种高度同源的同工酶
哺乳动物体内蛋白质可被多种糖链修饰，从而赋予其广泛的功能多样性。LacdiNAc（LDN，GalNAcβ1-4GlcNAc）是一种存在于N-糖链和O-GalNAc糖链中的独特二糖，可调节循环中糖蛋白的稳定性并抑制N-糖链的末端修饰。尽管已知两种高度同源的同工酶B4GALNT3和B4GALNT4均可合成LDN，但其功能差异尚不清楚。本研究比较了两者对N-糖链及糖蛋白的详细底物特异性、亚细胞定位、分泌情况，以及近期在其独特PA14结构域中发现的凝集素功能。酶活实验和凝集素辅助蛋白质组学分析显示，这两种酶具有不同的N-糖链分支特异性和底物蛋白选择性。此外，与B4GALNT3主要定位于高尔基体且分泌率较高相比，B4GALNT4部分定位于内质网且分泌较少。研究还发现，B4GALNT4的PA14结构域同样是一个凝集素结构域，可选择性结合硫酸化糖链，与B4GALNT3的凝集素结构域类似。添加一系列硫酸化糖链配体可在体外抑制B4GALNT3和B4GALNT4的活性，但两者的抑制谱略有不同。此外，阻断硫酸化对B4GALNT4胞内活性的增强作用弱于对B4GALNT3的作用，提示这两种酶以不同方式受到硫酸化糖链的负调控。综上，研究结果表明，参与LDN合成的两种同工酶B4GALNT3和B4GALNT4在某些功能和行为上相同，但在其他方面存在差异，为理解LDN生物合成的调控机制提供了线索。
研究背景方面，蛋白质功能受糖基化（glycosylation）严格调控，哺乳动物大量蛋白质被结构多样的N-糖链和O-糖链翻译后修饰，参与众多生理过程与疾病。糖链谱主要由内质网（ER）和高尔基体驻留的糖基转移酶（glycosyltransferase）协同作用形成，人体约有180种糖基转移酶。多数酶对受体寡糖底物的基本特异性已明确，但对糖蛋白的精细特异性及细胞内活性调控机制仍认识不足；同工酶的存在进一步增加了确定特定糖链生物合成途径的难度。LDN（GalNAcβ1-4GlcNAc）位于N-糖链和O-糖链的亚末端或末端，由B4GALNT3和B4GALNT4合成；含LDN的垂体激素糖链可调节其在循环中的清除，B4galnt3敲除（KO）小鼠血中硬化蛋白（sclerostin）异常升高致骨量减少，LDN还参与肿瘤病理与细胞干性，并抑制N-糖链多种末端修饰。此前发现B4GALNT3的PA14结构域是选择性结合硫酸化糖链配体的凝集素结构域，为糖蛋白活性所必需，短链磺基糖链配体可抑制其体外活性；B4GALNT4虽保守存在PA14结构域，但其凝集素功能、两同工酶在糖链与蛋白底物特异性、亚细胞定位及脱落方面的差异均不清楚。为此，研究人员系统比较了两者的酶学性质、细胞内行为与凝集素功能，以阐明其功能冗余与独立性，并为理解复杂糖链在哺乳动物细胞中的生物合成机制提供线索。
研究人员开展的主要关键技术方法包括：以B4GALNT3/4双敲除（DKO）HEK293细胞表达带或不带myc标签的酶，结合荧光标记（PA）受体糖链的反相高效液相色谱（HPLC）酶活分析及GALAXY数据库糖链结构归属；纯化重组可溶性His标签酶进行糖蛋白底物活性测定与WFA凝集素印迹；分子动力学（MD）模拟与MM/GB(P)SA结合能计算；凝集素辅助蛋白质组学（WFA磁珠富集结合nanoLC-ESI MS/MS、DIA-NN分析）；免疫荧光共定位、流式细胞术、免疫共沉淀及糖链微阵列（96种糖复合物）结合实验。细胞系来源为ATCC及合作者惠赠的DKO细胞。
研究结果如下。第一，B4GALNT3与B4GALNT4的比活性与分支偏好存在差异：细胞裂解液及纯化酶实验均显示B4GALNT4总活性显著低于B4GALNT3，两者α3-与α6-产物比例不同，B4GALNT3对α1,3-Man臂偏好更强；对N-与O-糖链底物的活性比亦不同；MD模拟显示B4GALNT4对两臂结合近乎等价，而B4GALNT3的α1,3偏好可能源于受体GlcNAc近攻击几何与催化位点驻留时间的差异。第二，两者对糖蛋白底物的活性不同：对触珠蛋白（Hp）、α1-抗胰蛋白酶（A1AT）、α1-酸性糖蛋白（A1AGP）、纤维蛋白原（Fib）的活性均为B4GALNT3更高，糖蛋白选择性相似，两者对A1AGP活性均极低；蛋白质组学鉴定出B4GALNT3与B4GALNT4表达样本中分别有62和20种独有候选底物蛋白，验证显示PTPRE几乎仅被B4GALNT3修饰、SERPINE2几乎仅被B4GALNT4修饰，而CHRM3与CSF2RA被两者相当修饰。第三，B4GALNT4产生的LDN同样抑制糖基转移酶的末端修饰：预先由MGAT3形成平分型GlcNAc几乎完全抑制两者活性；B4GALNT4表达使SNA凝集素结合下降至与B4GALNT3相似水平，并抑制HNK-1表位合成。第四，细胞内定位与脱落不同：B4GALNT3与高尔基体标志物GM130共定位显著高于B4GALNT4，B4GALNT4与内质网标志物钙联蛋白（calnexin）共定位更高；B4GALNT4的胞外分泌率明显低于B4GALNT3。第五，B4GALNT4的PA14结构域为识别硫酸化糖链配体的凝集素：AlphaFold预测两者糖结合位点结构相似而少数氨基酸不保守，催化位点供体识别关键残基完全保守；糖链微阵列显示两者PA14均结合有限的一组硫酸化糖复合物（如SO3-3Gal、SO3-6Galβ1-4GlcNAc、含3-O-硫酸化Gal与6-O-硫酸化GlcNAc的猪去唾液酸甲状腺球蛋白、硫酸软骨素二糖CS-A）；硫酸化二糖（尤其Δdi-6S）抑制两者对N-糖链和Hp的活性，但抑制谱略有差异，L4对B4GALNT4抑制更强、Δdi-4S对其抑制更弱；CHST8过表达降低两者活性，而SLC35B2/B3双敲除细胞中B4GALNT4产物几乎不增加，提示其受硫酸化糖链负调控的方式与B4GALNT3不同。第六，PA14结构域糖结合位点氨基酸替换实验：构建S215K、D251N、R253E互换突变体，S215K的WFA反应性和体外活性略有升高，但各突变体分支特异性均未改变，提示该位点差异可能部分贡献两者比活性差异。
讨论部分总结：B4GALNT3 mRNA主要表达于内分泌和胃肠道组织，B4GALNT4更特异表达于脑和女性器官，提示组织特异性功能；B4galnt3缺陷小鼠循环硬化蛋白升高致骨量减少，B4GALNT4在肺癌中上调可修饰SLC7A11抑制铁死亡，在前列腺癌中上调与不良预后相关，提示两者在生理过程与疾病中角色不同，今后需全面鉴定体内真实底物并开展B4GALNT4缺陷动物表型分析。两酶对α1,3-Man臂的偏好与B4GALT1、ST6GAL1、B3GAT1等一致，提示双天线N-糖链的延伸与封端可能先发生于α1,3臂；对A1AGP的低活性可能与识别特定氨基酸基序或区分糖链天线数有关。两酶定位与分泌差异可能与胞质尾长度及碱性基序（B4GALNT3为RRR、B4GALNT4为RK）相关，内质网定位的B4GALNT4可能无法合成LDN，构成负调控机制之一，其低脱落或与高尔基体蛋白酶切割减少有关。L4对两酶抑制差异可能贡献受体蛋白选择性差异，S215突变的效应提示PA14结构域精确作用值得进一步研究。
研究结论翻译：总之，本研究报道了B4GALNT3与B4GALNT4之间共享的若干性质以及存在差异的其他性质。人体中存在许多相似的糖基转移酶同工酶，但其明确的功能差异，尤其在体内条件下，在许多情况下仍不明了。由于细胞和组织糖链由包括同工酶在内的糖基转移酶整合作用所构建，为阐明复杂糖链生物合成机制，必须深入理解每种同工酶的活性及其调控机制。本研究的发现可为阐明哺乳动物细胞中LDN的生物合成途径提供线索，并为糖链谱如何在蛋白质和细胞层面建立提供见解。
